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文章題目：Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of onvalescent patients’B cells

雜志名稱：Cell

發(fā)表單位：北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG），首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，病原與生物安全國家重點實驗室，北京微生物研究所

發(fā)表時間：2020.05.13

主要技術(shù)：10x Genomics

Pick 理由：新冠熱點，單細胞熱點，數(shù)據(jù)挖掘和結(jié)構(gòu)預(yù)測兩種方式預(yù)測中和抗體

技術(shù)背景

新冠肺炎疫情在全球快速擴散蔓延，目前感染人數(shù)已經(jīng)超過 750 萬人，死亡人數(shù)超過 40 萬。全球科研人員都在積極努力，期望找到對抗新冠病毒的有效藥物，但是目前仍沒有針對新冠肺炎的有效藥物批準上市。

中和抗體是一類靶向病原體并阻斷病原體入侵細胞的特異性免疫球蛋白，由人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可以有效阻止病毒感染細胞。在新冠肺炎肆虐全球時，分離出有效的新冠抗體是一個重要的抗役措施。

研究表明，恢復(fù)期患者的血漿中含有由適應(yīng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的中和抗體，對輕度和重度 COVID-19 患者進行治療，均有明顯臨床改善作用。然而血漿不能量產(chǎn)，限制了這種治療方法的廣泛使用。但是從康復(fù)病人的記憶 B 細胞中分離出中和性單抗確實一種有前景的干預(yù)治療方法，這種方法具有良好的可擴展性和治療效果。

以病毒表面蛋白為靶點的人源單克隆抗體對艾滋病、埃博拉和中東呼吸綜合征等傳染病顯示出越來越多的治療和預(yù)防效果，它們對患者的安全性和效力已在多項臨床試驗中得到證實，因此對新冠也可以嘗試這種治療方案。

6 月 5 日，國家藥品監(jiān)督管理局正式批準中科院微生物所抗疫科技攻關(guān)團隊研制的新冠病毒全人源單克隆抗體的臨床試驗申請，I 期臨床試驗將在健康人體內(nèi)進行安全和劑量測試，這也是已經(jīng)完成了非人靈長類動物實驗后，在健康人群中開展的新冠肺炎治療性抗體臨床試驗。這標志著具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新冠病毒特異性抗體藥物成功進入人體臨床評價階段。

主要研究成果

1. 從 60 名新冠康復(fù)患者外周血中富集出 B 細胞，通過高通量單細胞 RNA 和 VDJ 測序快速鑒定出 SARS-CoV- 2 中和抗體。

2. 鑒定出 14 種有效的中和抗體，其中 BD-368- 2 中和效應(yīng)較強。

3. BD-368- 2 中和抗體對感染 sars-cov- 2 的 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠也有較強的治療和預(yù)防作用。

4. BD-368- 2 中和抗體與 spike-ectodomain 三聚體復(fù)合物的 3.8? 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示該抗體的表位與 ACE2 結(jié)合位點重疊。

5. 證明 SARS-CoV- 2 中和抗體可以根據(jù)其預(yù)測的 CDR3H 結(jié)構(gòu)與 SARS-CoV 中和抗體的相似性直接選擇。

在應(yīng)對大流行性傳染病時，通過高通量單 B 細胞測序可以有效地發(fā)現(xiàn)人的中和抗體。

實驗樣本

分 6 個批次共選取 60 例新冠康復(fù)病人的 PBMC 分離出 B 細胞，分別用 CD27 抗體和 RBD 蛋白分選特定類型的 B 細胞，進行單細胞 RNA 和單細胞 BCR 測序。CD27+ 富集細胞主要為記憶 B 細胞，生物素化 RBD 和 S 蛋白主要富集抗原結(jié)合的 B 細胞。經(jīng)過分選后每個樣本得到的 B 細胞數(shù)量并不多，因此采用多個樣本混合的方式。經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，得到 8,558 種不同的 IgG1 抗原結(jié)合克隆型。

數(shù)據(jù)總覽

分析內(nèi)容

通過 scRNA 數(shù)據(jù)和 scVDJ 數(shù)據(jù)結(jié)合，將記憶 B 細胞分成了不同的亞類。圖 D 顯示了挑選克隆的標準，包括 B 細胞類型，富集頻率，可變區(qū)域突變頻率，產(chǎn)生的抗體類型等。一般認為表達 IgG1 的 B 細胞對病毒刺激反應(yīng)強烈，且體細胞突變（SHM）頻率高的細胞親和力更強。

經(jīng)過篩選后篩選出 169 個理想候選克隆，通過轉(zhuǎn)染在 HEK293 細胞中表達。同時選擇了 47 個非理想克隆作為對照。通過 ELISA，表面等離子體共振等實驗發(fā)現(xiàn)只有 rbd 結(jié)合單克隆抗體具有偽病毒中和作用，同時只有 Kd 小于或接近 ACE2/RBD 解離常數(shù)的單克隆抗體與 RBD 結(jié)合。

從豐富克隆型分離的中和單抗中，有 7 種具有較強的中和能力，其抗 SARS-CoV- 2 假病毒的 IC50 低于 0.05 mol / l。單克隆抗體是 BD-368-2，與 BD-368 來自同一克隆型。

為了評估它們對真實病毒的中和能力，作者使用從 COVID-19 患者中分離的真實 SARS-CoV- 2 進行了血小板減少中和試驗（PRNT）。在所有測試的單克隆抗體中，BD-368- 2 對真實病毒的效力高，IC50 為 15 ng/mL。

為了進一步驗證 PRNT 顯示的真實的病毒中和作用，作者使用 BD-218 對真實的 SARS-CoV- 2 進行了細胞病理效應(yīng)（CPE) 抑制試驗。在 1.2 的濃度下，BD-218 對所有三次重復(fù)均表現(xiàn)出完全的病毒抑制作用。

為了評估鑒定出的中和單克隆抗體能否在體內(nèi)對 SARS-COV- 2 起到治療干預(yù)和預(yù)防性保護作用，作者測試了 BD-368- 2 對感染 SARS-COV- 2 的 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠的中和效果。9 只 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠分成三組，小鼠實驗采用 3 組共 9 只 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠。

1 組在病毒感染前 24 小時，將 BD-368- 2 腹腔注射進 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，檢測其預(yù)防效果。治療組在感染后 2h 注射 BD-368-2。對照組在感染后 2 小時注射抗 H7N9 病毒 IgG1 抗體（HG1K）作為陰性對照。

感染后 5 天內(nèi)，每天記錄每只小鼠的體重，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠體重明顯下降。

作者通過 qRT-PCR 分析了 5dpi 時肺部的病毒載量，發(fā)現(xiàn)在病毒攻擊前注射 BD-368- 2 可以完全抑制 SARS-CoV-2。在感染 2h 后注射可以明顯降低病毒載量。總之，小鼠實驗證明 BD-368- 2 在體內(nèi)具有較高的治療和預(yù)防作用。

通過克隆富集篩選有親和力的抗體是一種高效的方法，然而由于取樣限制，在很多樣本中，大量克隆并未出現(xiàn)明顯富集和擴增，可能導(dǎo)致信息的遺漏，因此使用抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測來注釋 Ig-seq 數(shù)據(jù)，可以更好地選擇單克隆抗體。研究表面通過比較與參考中和單抗 CDR3H 結(jié)構(gòu)的相似性選擇抗體是一種有效的方法。

然而對于新冠病毒來說，目前并無可用的參考抗體。

為了解決這一問題，作者使用 3.8 ?分辨率下 BD23-Fab 與 S 胞外域三聚體復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。在這個三維重建結(jié)構(gòu)中，每個 S 三聚體觀察到一個單一的 BD23-Fab，它與原聚體 B 中的“下”RBD 結(jié)合，且只有 BD-23 的重鏈可變區(qū)參與 RBD 結(jié)合。事實上，與 RBD-ACE2 復(fù)雜結(jié)構(gòu)的比較表明，BD23-Fab 與 ACE2 競爭與 RBD 的結(jié)合。

這一觀察結(jié)果表明，BD-23 中和 SARS-CoV- 2 的能力來自于 ACE2-RBD 結(jié)合的破壞，這與之前鑒定的中和 SARS-CoV 的單克隆抗體高度相似。

綜上所述，SARS-CoV 和 SARS-CoV- 2 之間的結(jié)構(gòu)有高度保守性，利用 SARS-CoV 中和單克隆抗體的晶體結(jié)構(gòu)作為參考，篩選具有相似 CDR3H 結(jié)構(gòu)的 SARS-CoV- 2 抗原結(jié)合克隆型來識別中和單克隆抗體也是可行的。

鑒定出的單克隆抗體的 CDR3H 序列與 m396 (2dd8) 高度同源，通過破壞 ACE2/RBD 結(jié)合發(fā)揮中和 SARS-CoV 效應(yīng)。

令人驚喜的是，作者發(fā)現(xiàn)的 12 個單克隆抗體中有 7 個表現(xiàn)出強烈的 RBD 結(jié)合親和力，對偽 SARS-CoV- 2 病毒具有有效中和能力。三種具有代表性的單克隆抗體 BD-503、BD-508 和 BD-515 的中和能力在真 SARS-CoV- 2 的 PRNT 中也得到驗證，顯示出很高的中和能力。這些單克隆抗體多編碼重鏈 VH3-66/JH6 或 VH3-53/JH6 基因片段，輕鏈 VLK1- 9 或 VLK1 -33/39 基因片段。

使用雙抗體夾心 ELISA 進行的表位封裝實驗表明，BD-503、BD-508 和 BD-515 可能共享一個重疊的表位。還需要更多的結(jié)構(gòu)分析來獲得準確的表位，以確定它們是否具有較大的保守性。

小結(jié)

近日北京新冠確診人數(shù)的增加讓人們對新冠的警惕性進一步提升。作者鑒定的強中和抗體可能提供一種有效的治療和預(yù)防方案，在 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠上的結(jié)果證明了這一點。使用 BD-368- 2 的臨床試驗正在進行中。我們期待良好的臨床實驗結(jié)果，也期望本文中的方法可以擴展應(yīng)用到其他傳染病的研究與治療中。

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