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伯豪生物
單細(xì)胞 TCR/BCR 測(cè)序
 電子資料 調(diào)研問(wèn)卷
伯豪生物新官網(wǎng)消息

技術(shù)簡(jiǎn)介

免疫組庫(kù)(Immune Repertoire,IR)是指機(jī)體內(nèi) T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞多樣性的總和,反映機(jī)體免疫系統(tǒng)在特定時(shí)間段內(nèi)應(yīng)對(duì)外界刺激應(yīng)答的能力?;?10X Genomics 的單細(xì)胞系統(tǒng),可實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 V(D)J 測(cè)序。不但可以將 TCR/BCR 雙鏈匹配,而且能夠同時(shí)獲得基因表達(dá)信息。

技術(shù)原理

10X Genomic 單細(xì)胞免疫組庫(kù)測(cè)序與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序一樣,通過(guò)微流控系統(tǒng)將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中;接下來(lái)在每個(gè)油滴內(nèi),凝膠珠溶解,細(xì)胞裂解釋放 mRNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油(Breaking Emulsions)之后,cDNA 一分為二,后續(xù)同時(shí)進(jìn)行基因表達(dá)和免疫組庫(kù)的文庫(kù)構(gòu)建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通過(guò)設(shè)計(jì)在 C 區(qū)的巢式引物進(jìn)行 PCR 富集;而 mRNA 的信息,與 10X Genomics 3’mRNA 文庫(kù)不同,保留的是 5’端的信息。測(cè)序后即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)。

?圖 5’mRNA 與 TCR/BCR 同時(shí)建庫(kù)

圖 5’mRNA 與 TCR/BCR 同時(shí)建庫(kù)

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伯豪優(yōu)勢(shì)


1、通量高:一張芯片具有 8 個(gè)獨(dú)立的通道,可供 8 個(gè)樣本同時(shí)上機(jī),每個(gè)通道可捕獲 10000 個(gè)細(xì)胞。

2、分辨率高:可獲得真正單細(xì)胞水平的的免疫組庫(kù)信息,并且可匹配 TCR/BCR 的雙鏈。

3、信息豐富:可同時(shí)獲得單個(gè)細(xì)胞匹配的 mRNA 和 TCR/BCR 信息。


文庫(kù)結(jié)構(gòu)

5’gene expression 文庫(kù)

5’gene expression 文庫(kù)構(gòu)建單細(xì)胞測(cè)序

圖 10X Genomics 5’gene expression 文庫(kù)示意圖

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V(D)J 文庫(kù)

V(D)J 文庫(kù)

圖 10X Genomics V(D)J 文庫(kù)示意圖

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建議測(cè)序深度及參數(shù)

指標(biāo)

參數(shù)

測(cè)序深度 -5’mRNA

50,000~100,000 reads/cell

測(cè)序深度 -TCR/BCR

5,000~10,000 reads/cell

測(cè)序類型

PE150

樣本要求

1、類型:新鮮組織,原代細(xì)胞,細(xì)胞系等。

2、來(lái)源:血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量及其它質(zhì)控要求:

樣本類型 要求
細(xì)胞懸液 > 10* 目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)(底限 10,000 個(gè)細(xì)胞);
? 活率 >80%;
濃度 500-1,000 個(gè)細(xì)胞 /ul;
細(xì)胞間無(wú)粘連(成團(tuán)率 <5%);
無(wú)大于 40um 的細(xì)胞碎片或其他顆粒物;
不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。
血液 EDTA 抗凝的全血(不可肝素抗凝),>5ml。
組織 0.3cm × 0.3cm(不超過(guò) 0.5 × 0.5cm)的新鮮組織,4~5 塊。


4、樣本的保存與運(yùn)輸


樣本類型 要求
細(xì)胞懸液 建議現(xiàn)場(chǎng)制備,如要運(yùn)輸,建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液,4°C 運(yùn)輸,48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。
血液 EDTA 抗凝的全血,4°C 運(yùn)輸,2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室;或提取 PBMC 后凍存,干冰運(yùn)輸。
組織 建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞組織保護(hù)液,4°C 運(yùn)輸,48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

應(yīng)用領(lǐng)域

1、腫瘤微環(huán)境;

2、自身免疫性疾病;

3、感染性疾病;

4、器官、骨髓移植;

5、抗體開(kāi)發(fā)。


案例展示


1、肝癌免疫微環(huán)境

2017 年,北京大學(xué)張澤民教授課題組通過(guò)大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)肝癌相關(guān) T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了分析,在單細(xì)胞水平上描繪肝癌微環(huán)境中免疫圖譜。研究者收集了 6 例肝癌患者的外周血,癌旁正常組織、肝癌組織作為實(shí)驗(yàn)樣本,然后從各類樣本中用流式分選出 CD3+CD8+(cytotoxic T cells,Tc)細(xì)胞,以及 CD4+CD25-(Helper T cells,Th)細(xì)胞和 CD4+CD25+(regulatory?T cells,Tregs)細(xì)胞,并進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞 TCR 測(cè)序,總共獲得 5063 個(gè)單細(xì)胞的數(shù)據(jù)。其中,單細(xì)胞水平分析 TCR 序列發(fā)現(xiàn),在腫瘤侵潤(rùn)的 exhausted T 細(xì)胞和 Tregs 細(xì)胞中,觀察到 TCRs 發(fā)生了重復(fù)使用。在腫瘤組織中含有相同 TCR 的 T 細(xì)胞比例較高,而在外周血和正常組織中比例較低,這說(shuō)明在腫瘤中的 exhausted T 細(xì)胞和 Tregs 細(xì)胞發(fā)生了克隆擴(kuò)增。并且相比于早期病人,晚期病人中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增更加明 顯。

肝癌免疫微環(huán)境圖

圖 肝癌中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增

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2、黑色素瘤免疫微環(huán)境

2019 年發(fā)表在 Cell 上發(fā)表的一篇論文,對(duì) 25 個(gè)黑色素瘤患者腫瘤中總共 46,621 個(gè)免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 和 TCR 測(cè)序。這些細(xì)胞被分成 7 個(gè)大群,包括 T 細(xì)胞(CD3),NK 細(xì)胞(KLRD1),樹(shù)突細(xì)胞(DCs;CD1C),巨噬細(xì)胞(C1Q),單核細(xì)胞(VCAN),B 細(xì)胞(CD19),和漿細(xì)胞(immunoglobulins)。初始 T 細(xì)胞高表達(dá) IL7R, CCR7 和轉(zhuǎn)錄因子 TCF7,特異性表達(dá)的基因整體來(lái)說(shuō)比其它類型的細(xì)胞少。而非初始 T 細(xì)胞具有很高的異質(zhì)性,其中一小群是記憶 T 細(xì)胞,大部分細(xì)胞是過(guò)渡性 CD8 T 細(xì)胞(transitional CD8 effector T),細(xì)胞毒性 CD8 T 細(xì)胞(cytotoxic CD8 effector T)和喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞(dysfunctional CD8 T cells),高表達(dá) PD- 1 和 LAG3。這些細(xì)胞類群的邊界是模糊的,提示轉(zhuǎn)錄的梯度表達(dá)是造成 T 細(xì)胞異質(zhì)性的原因。CD4 T 細(xì)胞主要有高表達(dá) FOXP3 的 Treg,濾泡輔助 T 細(xì)胞(CXCL13 表達(dá)),以及一小群高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子的細(xì)胞(dysfunctional CD4 T cells)。分析每名患者的免疫細(xì)胞組成,發(fā)現(xiàn)大部分 T 細(xì)胞類群在患者中都存在,但是病人之間不同細(xì)胞類群的豐度有很大差異。喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞的負(fù)荷可能是黑色素瘤本質(zhì)的特征。

病人間免疫微環(huán)境異質(zhì)性

圖 病人間免疫微環(huán)境異質(zhì)性

通過(guò)分析 T 細(xì)胞的 TCR 序列,發(fā)現(xiàn)不同病人的 TCR 克隆型構(gòu)成差異較大。一些大的克隆中細(xì)胞類型也不同,主要表現(xiàn)為喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞的富集和初始 T 細(xì)胞的缺失?;颊咧袉适Чδ艿?CD8 T 細(xì)胞的比例與 T 細(xì)胞的擴(kuò)增程度呈現(xiàn)正相關(guān)。通過(guò)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的增殖分?jǐn)?shù),發(fā)現(xiàn)喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞有高增殖細(xì)胞比例,比初始 T 細(xì)胞高出 10 倍。

圖 黑色素瘤中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增

圖 黑色素瘤中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增


3、免疫治療

靶向 PD-1/PD-L1 通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn),給癌癥的臨床治療帶來(lái)了革命性的變化。然而 人們對(duì) PD-1 抗體的抑癌機(jī)制并不了解。其中一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題是 PD- 1 抗體的抑癌效果,究竟是依賴于在治療前就存在于腫瘤中的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的再激 活,還是治療之后,腫瘤外的殺傷 T 細(xì)胞進(jìn)入腫瘤?這個(gè)問(wèn)題,目前也是不清楚的。來(lái)自斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì),從接受 PD- 1 抗體治療前后的基底細(xì)胞癌(BCC)或鱗狀細(xì)胞癌(SCC)患者身上采集了 79046 個(gè)細(xì)胞(包括癌細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞),進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和 TCR 測(cè)序?;趩渭?xì)胞 RNA 測(cè)序結(jié)果,細(xì)胞分成 19 個(gè)亞群。

本研究的重點(diǎn)是免疫細(xì)胞,尤其是浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞,以及治療前后的變化,以了解克隆性 T 細(xì)胞對(duì) PD- 1 抗體治療的反應(yīng)。因此研究人員把所有的 33106 個(gè)腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞做了個(gè)更細(xì)致的分類,包括表達(dá) CD4 的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)細(xì)胞,濾泡輔助性 T(TFH)細(xì)胞,T 輔助細(xì)胞 17(TH17)細(xì)胞;以及表達(dá) CD8 的幼稚細(xì)胞,記憶 T 細(xì)胞,效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞,活化 T 細(xì)胞,慢性活化 / 耗竭 T 細(xì)胞,中度耗竭 / 活化細(xì)胞。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在 PD- 1 抗體治療之后,濾泡輔助性 T 細(xì)胞,以及活化,耗竭和耗竭 / 活化的 CD8 陽(yáng)性 T 細(xì)胞的頻率增加,并且耗竭 T 細(xì)胞的克隆水平明 顯更高。更為讓研究人員感到意外的是,對(duì)于同一個(gè)患者而言,治療后記憶 T 細(xì)胞和效應(yīng) T 細(xì)胞頻繁轉(zhuǎn)換為活化狀態(tài),但是治療前的耗竭 T 細(xì)胞卻沒(méi)有變成治療后的非耗竭表型。這表明,即使在 PD- 1 抗體治療后,已經(jīng)耗竭的腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞也很難變成活化狀態(tài)了。

圖 治療前后 T 細(xì)胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)換

圖 治療前后 T 細(xì)胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)換。

此外,研究人員還觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象,PD- 1 抗體治療后才出現(xiàn)的耗竭性 T 細(xì)胞表現(xiàn)出了新的 TCR 特異性。為了分析外周血中是否存在新發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞,研究人員給患者的血液樣品做了 TCR 測(cè)序,發(fā)現(xiàn) 35.5% 新腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞可以在 PD- 1 抗體治療后的外周血中找到,而在治療前的外周血中只能找到 11.8% 的新腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞,不過(guò)治療前的腫瘤里面卻沒(méi)有新腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞。

圖 新發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞在外周血中的比例

圖 新發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞在外周血中的比例

總的來(lái)說(shuō),與“冷”腫瘤相比,“熱”腫瘤之所以響應(yīng) PD- 1 抗體的治療,可能是由于“熱”腫瘤自身的特性,讓它能夠不斷吸引新 T 細(xì)胞進(jìn)入,而不是重新激活已有的腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞。這項(xiàng)研究讓我們對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的作用機(jī)制有了新的認(rèn)知,這對(duì)臨床治療和療效的檢測(cè)都有一定的價(jià)值和意義。



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