單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）技術的飛速發展使人們對組織中細胞種類、細胞的特殊狀態有了深入認識。但是，scRNA-seq 對于器官或者固體組織制備的細胞懸液的細胞活性和細胞數目有著較高的要求，這也意味著“躺在”超低溫冰箱中的大量珍貴臨床樣本（腦組織，腫瘤組織等）都無法進行 scRNA 測序。而單細胞核 RNA 測序技術（snRNA-seq）的出現，則在很大程度上解決了以上問題。

雖然細胞核內的遺傳物質可以大體代表整個細胞，然而，細胞質和細胞核之間的 RNA 類型和比例卻存在一定的差異。RNA 首先在細胞核內轉錄，并在細胞核內積累到穩定狀態。在細胞質中，mRNA 根據其出核率和不同的命運，包括轉運到特定的亞細胞位置、核糖體的翻譯、小 RNA 的降解等，達到不同的穩態水平。研究人員發現，細胞核 RNA 中含有大量的非編碼序列，其中包含 41% 的基因間區序列和 25% 的內含子序列。同時，研究人員也發現有 41.7% 的轉錄本序列只在細胞核中存在。多項研究表明，將內含子區域的 reads 增加了 snRNA-seq 的敏感性，并提高識別細胞類型的分辨率。因此，在處理單細胞核 RNA 測序數據時，納入內含子序列具有重要意義。下面，就讓我們詳細了解一下針對不同組織樣本進行 snRNA-seq 的部分案例與要點。

腦組織樣本的 snRNA-seq

對于腦組織來說，scRNA-seq 并不能全面地分析神經細胞的類型。一些細胞類型更容易受到組織解離過程的影響，比如在成人的新大腦皮層中，非神經元細胞在解離中比神經元耐受性更好，在單細胞懸浮液中大量存在；在小鼠新皮層中，第 5 層 parvalbuin 陽性的間神經元和皮質下突起的谷氨酸能神經元的比例低于預期。相反，細胞核對機械處理更有抵抗力，可以從冷凍組織中解離出來。研究發現，單個細胞核已被證明可以提供足夠的基因表達信息來定義成人大腦和小鼠海馬區相對寬泛的細胞類別。此外，新鮮解離的神經組織很難獲得；相比之下，從意外去世或者因疾病去世后病人處所獲得的正常和疾病組織，是研究大腦組織中細胞類型的主要樣本類型。但是，這些組織通常是冰凍的樣本，因此 snRNA-seq 是解決細胞類型少以及冰凍樣本的重要方法。

研究發現，從冷凍的 S1 皮層中分離單個核，進行神經核抗原（NeuN) 流動分選，并在 Fluidigm C1 系統上進行 RNA 測序，細胞核和細胞數據顯示檢測到的基因數量和類型相似（S1 細胞核 - 平均 5619 個基因；S1 細胞 - 平均 4797 個基因）。核數核據含有較高比例的內含子 reads。

圖。SnRNA-seq 揭示了興奮性神經元的特性

Grubman?等人通過對從去世后的阿爾茨海默氏癥患者和年齡匹配的非疾病患者身上提取的內嗅皮層組織進行 snRNA-seq，得到了 13,214 個細胞，每個細胞中位數檢測到 646 個基因。UMAP 顯示，共鑒定到了小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、少突膠質祖細胞（OPCs)，少突膠質細胞和內皮細胞。

圖。人內嗅皮層 snRNA-seq 揭示阿爾茨海默病中細胞類型特異性標記基因和細胞類型特異性改變

同樣是阿爾茲海默癥疾病，Mathys 等人通過對冷凍的去世后病人腦組織進行 snRNA-seq，共鑒定到了人類大腦的主要細胞類型：興奮性神經元（NRGN 標記），抑制性神經元（GAD1)，星形膠質細胞（AQP4)，少突膠質細胞（MBP)，小膠質細胞（CSF1R 和 CD74)、少突膠質祖細胞（VCAN)、內皮細胞和周細胞（AMBP)。

圖。snRNA-seq 譜分析阿爾茲海默癥病人腦組織中細胞類型

心臟組織樣本的 snRNA-seq

在心臟的單細胞 RNA 測序研究中也存在著許多難點。首先，成年的心臟組織較難消化，很難保證在不損傷細胞的情況下，得到高質量的細胞懸液；再者，由于心肌細胞大，且形狀不規則，導致細胞捕獲較難。因此，心臟的研究通常依賴胚胎和新生兒的小鼠心臟或關注成年小鼠心臟的非心肌細胞群來避免這些問題。2020 年發表的一篇關于哺乳動物心臟單細胞核 RNA 測序探索細胞成分和細胞特征的文章，則在一定程度上掃除了心臟單細胞 RNA 測序的障礙。snRNA-seq 分析得到了 8635 個細胞核和 22,568 個基因，每個細胞平均得到 2662.6 reads。UMAP 顯示了 24 個不同的細胞類群，其中較多的是內皮細胞（28.8%)、成纖維細胞（25.3%) 和心肌細胞（22.8%)，它們分別含有約 2500 個、2200 個和 2000 個細胞核。

圖。snRNA-seq 譜分析心臟組織中細胞類型

Cui 等人使用 snRNA-seq 揭示再生新生兒和非再生晚期心臟心肌細胞的不同群體。結果表明，一個明顯的未成熟的心肌細胞群體進入細胞周期響應損傷。對這些心肌細胞的轉錄組分析揭示了支持新生兒再生反應的基因調控網絡，該網絡的缺失與再生阻斷相一致。

圖。snRNA-seq  確定新生兒心臟中不同的心肌細胞群

腎臟組織樣本的 snRNA-seq

2019 年，來自華盛頓大學醫學院的 Benjamin D. Humphreys 團隊比較分析了腎臟組織的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq) 和腎臟組織的單細胞核 RNA 測序（snRNA-seq) 在腎臟細胞類群鑒定中的區別。與 scRNA-seq 相比，snRNA-seq 捕獲了多種在 scRNA-seq 數據集中不存在的腎臟細胞類型，包括腎小球足細胞、系膜細胞和內皮細胞。同時也未檢測到應激反應基因。與已發表的 scRNA-seq 數據集（分別為 2.4% 和 0.12%) 相比，snRNA-seq 方法產生了 20 倍以上的足細胞。

圖。加上內含子 reads，snRNA 測序的表現相當于或優于 scRNA 測序

Wilson 等人通過對冷凍保存的糖尿病人腎臟樣本進行 snRNA-seq，共得到 23,980 單細胞核數據，其中包括 11 種腎臟細胞類型和 4 種免疫細胞類型（近曲小管；CFH，補體因子 H 陽性細胞；亨利循環細胞；遠曲小管細胞；連接小管細胞；集尿管細胞；主細胞；插入細胞；阿足突細胞；內皮細胞；系膜細胞；白細胞）。

圖。snRNA 測序鑒定腎臟細胞及免疫細胞種類

結語

總結而言，單細胞核測序技術在樣本適用性上較單細胞 RNA 測序技術更有優勢，它不局限于新鮮的組織樣本，適用于冰凍樣本。此外，單細胞核的制備相對于單細胞懸液的制備要更簡單，可以盡量減少酶解，機械壓力誘導的假的細胞類群的產生。在數據分析方面，單細胞核 RNA 測序可以獲得內含子區、基因間區的數據，使細胞類型的鑒定分辨率更高，獲得的基因信息相對更加豐富。

但是單細胞核測序可以取代單細胞 RNA 測序么？答案一定是 NO!  在選擇兩種方法時，要更多的結合自身的條件來確定。自己有什么樣本？是否可以制備合格的細胞懸液？是否有對酶敏感的細胞類型？各項因素都需要綜合考慮。未來，單細胞核 RNA 測序與單細胞 RNA 測序的結合可能是全面獲得樣本中細胞類型的策略。也讓我們期待廣大的科研工作者來解密。

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