腫瘤內異質性對癌癥患者的準確診斷和建立個性化治療策略帶來了重大挑戰。這種異質性可能是治療耐藥性、疾病進展和癌癥復發的基礎。為了提高免疫治療效果， 研究人員使用 空間轉錄組 技術（spatial transcriptome，ST) 來識別，阻斷腫瘤異質性的來源，提供識別新的生物標志物的能力，并深入了解腫瘤細胞、脂肪組織、血管、三級淋巴結構和 TME 間基質之間的動態相互作用。 目前多項技術已經被應用于癌癥組織內的這種分析，包括，原位雜交，數字空間分析以及一種新興技術的 10×Genomics Visium 空間基因表達解決方案。10×Genomics Visium 產生定量基因表達數據，并將它們映射到組織結構上。通過保留空間信息可以很好地識別新的生物標志物，該技術可能會影響新的組合免疫療法。
多重免疫組化 / 免疫熒光（mIHC/IF) 是一種常用的工具，可同時檢測單個組織樣本中多達 40 個感興趣的標記物。與單獨分析腫瘤突變負荷（TMB) 或基因表達譜（GEP) 相比，這種方法能更好地預測細胞對 PD-1/PD-L1 治療的反應。
下面為大家介紹幾種空間轉錄組技術，及各種技術的特點：
01、 原位雜交技術（In Situ Hybridization，ISH）
原位雜交（ISH) 是一種在細胞或組織中可視化特定 DNA 或 RNA 分子的分子技術。ISH 是基于互補性質的 DNA/DNA 或 DNA/RNA 雙鏈和標記核酸探針的原位雜交到靶序列上。通過這種方式，我們可以獲得有用的空間信息。傳統方法，核酸探針附著在放射性標簽上。目前這種方法已被螢光顏料所取代。也就現在大家所熟知的熒光原位雜交技術（FISH）。FISH 本身已經進一步發展成為一種被稱為多重單分子 FISH (smFISH) 的技術，它能夠在單分子分辨率下同時檢測大約 10,000 個基因和每個細胞大約 70,000-100,000 個 RNA 分子。下面為大家概述每種技術的基本原理：
熒光原位雜交（FISH）
FISH 是檢測微生物、診斷實體癌癥和血液癌癥以及指導癌癥治療的有用的臨床工具。例如，FISH 已被常規用于檢測慢性髓系白血病中的 BCR-ABL1 t(9;22) 易位和各種癌癥中的許多融合基因。FISH 還被用于確認乳腺癌中的人表皮生長因子受體 2 (HER2) 基因擴增，從而識別有可能從曲妥珠單抗（一種針對 HER2 的單克隆抗體治療）中獲益的患者。隨著更多免疫療法的開發和批準，研究人員已經尋求使用 FISH 來預測癌癥免疫治療的反應性。為了擴大 FISH 的有效性，將 FISH 與 IHC 或 IF 結合，同時檢測不同細胞類型的 RNA 和蛋白質，可以更好地來表征 TME。
Single-Molecule FISH（smFISH）和 RNAscope
為了解決傳統 FISH 的局限性，研究工作已經從 DNA 研究轉向了單分子 RNA 的研究，并且使用高通量的方法。由此產生的技術，稱為單分子 FISH (smFISH)，允許研究人員可視化和量化單個 mRNA 分子，并表征內源性基因表達的空間模式。
RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA) 是一種商業化的基于 ISH 的技術，使用分支 DNA 和信號放大實現比傳統 FISH 更好的靈敏度和特異性：通過這種方法，研究人員可以在抑制背景噪聲的同時檢測和量化低含量的 mRNA。這種方法可以檢測多達 12 種不同的 RNA 靶點，可以方便地與免疫組化和 / 或 IF 結合，以自動化的方式同時研究 RNA 和蛋白質。RNAscope 相對于其他基于 FISH 的技術的一個主要優勢是，13000 個 RNA 探針已經被設計并通過商業建立的協議進行驗證；因此，它是一種用于研究和臨床實驗室的省時和友好的方法。通過檢測一種感興趣的特定 RNA, RNAscope 已經揭示了 TME、免疫逃逸機制和新的預測和預后癌癥生物標志物。
Multiplexed smFISH
雖然研究人員可以通過 RNAscope 等技術獲得更高的敏感性和特異性，但需要一種基于 FISH 的高通量轉錄組分析技術來更好地表征具有獨特基因表達譜的罕見細胞群和細胞類型。比如多重糾錯 FISH(MERFISH) 和序列 FISH(seqFISH)，不僅提供了改進的 RNA 定量、信號放大和檢測，而且更重要的是，提供了基于圖像的轉錄組分析。
MERFISH 由 smFISH 改良而來，采用基于條形碼的組合標記方法，隨后進行多輪雜交，以確保高水平的熒光信號亮度和可同時檢測到的大量 RNA (圖 1)。MERFISH 可以實現接近全基因組分析和 90% 的檢測效率，在人類骨肉瘤細胞中已經證明。與傳統的 FISH 相比，MERFISH 還提供了額外的好處，即能夠以低豐度量化單個 RNA 分子。
圖 MERFISH 原理
seqFISH 是另一種多重 smFISH 技術，它是基于連續多輪的條形碼雜交標記技術。它可以提供亞衍射極限的空間分辨率，優于其他 RNA 分析技術。例如，seqFISH 對小鼠胚胎干細胞和腦組織中的 10000 種 mRNA 進行了高精度、高分辨率的成像。Zhou 等人證明 seqFISH 是一個研究和獲得 t 細胞成熟過程中調控基因表達動態的強大工具。Voith von Voithenberg 等人將微流體技術與多路 smFISH 相結合，研究乳腺癌中的腫瘤異質性。
圖 seqFISH 原理
smFISH 和多重 smFISH 是單細胞 RNA 測序研究和量化細胞 RNA 的替代方案，因為它提供了單細胞甚至單分子水平上的亞細胞空間信息。然而，盡管基于 smFISH 的多重技術很有前景，但由于復雜的探針設計、驗證、圖像分析和解碼，它還沒有廣泛應用于轉化研究或臨床設置。通常使用非多重 FISH、定量 PCR、免疫組化、IF 等方法在 mRNA 或蛋白水平上研究單個基因表達更為方便，特別是當研究的基因數量較小時，如一套預后標志物。另一個限制是，與其他技術相比，因為序列雜交，成像時間加起來至少 18 h，還不包括 36-48 h 的探針雜交時間，導致整體的通量較低 (表）。此外，多重 smFISH 技術只能評估新鮮冷凍組織中一種類型的分析物，如 RNA。新興的技術，如數字空間分析，可以評估新鮮冷凍組織和病理醫師經常使用的標準福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE) 組織中的蛋白質和 RNA 水平。
表：多種空間轉錄成像技術對比
02、 空間轉錄組（Spatial Transcriptomics，ST）
在單細胞 RNA 測序過程中，空間信息丟失。盡管該技術被廣泛用于探索單細胞水平的基因表達譜，但它的捕獲效率和測序覆蓋率較低，以及高丟失率，這些都可能影響后續數據的分析和解釋。
隨著一家名為“空間轉錄組學”（Spatial Transcriptomics，Stockholm, Sweden) 的公司率先開發的技術的發展，空間基因組學這一新興領域進入了人們的視線。該技術利用空間條形碼寡脫氧胸腺嘧啶微陣列實現完整組織切片中的轉錄組定量可視化和分析。在進行 RNA 測序過程之前，將獨特的位置條形碼引入玻片，以保持組織結構中的空間位置。
圖 Visium Spatial Gene Expression Solution 原理
這項新技術首先在小鼠嗅球上進行，包括組織包埋，組織切片、固定、蘇木精和伊紅（H&E) 染色、亮視野成像、組織通透化、cDNA 合成、組織移除、探針釋放、文庫準備、測序、數據處理、數據可視化和分析。值得注意的是，該工作流程的一個顯著特征是能夠生成帶有保留空間信息的載玻片 cDNA 文庫，使其能夠可視化地將基因表達譜映射到相應的組織形態。
目前該技術已經用于多種疾病類型，包括研究人員在乳腺癌、前列腺癌和皮膚惡性黑色素瘤活檢中發揭示了腫瘤內部及之間的異質性，以及癌和癌旁間差異的基因表達譜。當然，組織病理學注釋和單細胞 RNA 測序可以分別識別異常的組織形態和確認存在遺傳上不同的細胞群；然而，ST 可以根據基因表達譜來識別不同的空間區域。 基于空間轉錄組公司首創的概念，10X genomics 公司發布了 Visium Spatial Gene Expression Solution (10×Genomics, USA)，與第一代 ST 技術相比，Visium Spatial Gene Expression Solution 具有更高的分辨率和更高的靈敏度。 為了進一步挖掘 ST 的潛力，研究人員近開發了一種被稱為多模態交叉分析（MIA) 的分析方法。MIA 結合了單細胞 RNA 測序和 ST 技術生成的數據集，可以將細胞定位到組織上特定的區域。
盡管 10X genomics 公司發布了 Visium Spatial Gene Expression Solution 為科學研究帶來了很大的希望，但它仍然有局限性。 首先，盡管官方推薦的組織切片厚度是 10μm，但是這個值還要取決于組織類型和成分。10×Genomics 提供了一個支持網站，上面提供了兼容組織和相應厚度的更新列表。到目前為止，已經列出了 4 種大鼠組織、20 種小鼠組織和 19 種人類組織，還有 4 種組織計劃進一步優化。此外，10×Genomics 還被建議對每一種新的組織類型進行一次優化實驗，因為組織通透性條件在組織、物種甚至實驗室之間是不同的。其次，Visium 僅在新鮮冷凍標本中得到驗證，針對于 FFPE 標本的解決方案也會在不久后推出。每個組織捕獲區域包含~ 5000 個 spot 點，根據組織類型和厚度的不同，每個點可以捕獲 1 -10 個細胞。 雖然有些人可能認為這項技術令人滿意，但在需要獲得詳細細胞類群信息時仍需要做額外的工作。先進的解決方案是將 MIA 分析方法集成到分析工作流中，以允許在細胞級別進行識別。盡管存在這些限制，但由于 visium 可以迅速識別基因表達譜，并在不丟失空間信息的情況下檢測出癌癥起始和進展的新特征， 因此 10×Genomics visium 技術是目前有潛力及前景的技術 。
參考文獻：
Nerurkar S N, Goh D, Cheung C C L, et al. Transcriptional Spatial Profiling of Cancer Tissues in the Era of Immunotherapy: The Potential and Promise[J]. Cancers, 2020, 12(9): 2572.
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