導(dǎo)讀

近日，Microbiol Spectr 雜志發(fā)表了一項(xiàng)初步研究，旨在探索 DNA 甲基化與結(jié)核潛伏感染（LTBI）人群活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)生的關(guān)聯(lián)研究。該研究主要由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所完成，研究采用巢式病例對照設(shè)計(jì)，回顧性檢測 LTBI 人群中發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核者與未發(fā)病者 DNA 甲基化程度，探索 DNA 甲基化與 LTBI 人群發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核的關(guān)系，為尋找 LTBI 與活動(dòng)性肺結(jié)核的鑒別診斷生物標(biāo)志物提供新的思路。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所的博士生杜瑩為文章的第一作者，高磊研究員與辛赫男副研究員為文章的通訊作者。

科學(xué)問題

針對 LTBI 高危人群開展預(yù)防性治療是直接降低發(fā)病率，實(shí)現(xiàn) 2035 年“END TB”全球戰(zhàn)略目標(biāo)的重要手段。目前，肺結(jié)核的診斷仍然是以病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)）檢測為主，存在敏感性低、周期長、易受痰標(biāo)本質(zhì)量影響等問題。探索基于宿主血液的生物標(biāo)志物用于診斷活動(dòng)性肺結(jié)核一直是領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。DNA 甲基化是目前研究比較廣泛的表觀遺傳方式，本研究以此為切入點(diǎn)，探索 DNA 甲基化與活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)生的關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

樣本： 外周血 PBMC

分組： 分別收集基線及隨訪時(shí)的自身前后兩份外周血樣本進(jìn)行分子標(biāo)識研究。基線時(shí)共 1155 例未進(jìn)行預(yù)防性治療的結(jié)核潛伏感染者參與了該研究，通過 5 年隨訪，共有 26 例研究對象發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，從中選擇有足夠外周血單核細(xì)胞的 15 例調(diào)查對象作為病例組，并根據(jù)年齡、性別匹配了 15 例未發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核的調(diào)查對象作為對照組。

技術(shù)：850K 甲基化芯片（伯豪提供）

實(shí)驗(yàn)思路

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 調(diào)查對象基本信息

對 30 例研究對象的自身前后兩份樣本共 60 份樣本進(jìn)行了 850K 芯片篩選，其中包括 15 例結(jié)核病患者（11 例病原學(xué)確診病例及 4 例臨床確診病例）和 15 例年齡、性別匹配的結(jié)核潛伏感染對照組。30 例調(diào)查對象的年齡中位數(shù)為 65（62，68）歲，以男性居多（73.33%，22/30）。兩組的 IFN- γ 釋放水平、吸煙和飲酒間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，病例組的 BMI 低于對照組（P=0.025），但均在正常范圍內(nèi)。

▲表 1   LTBI 人群隊(duì)列信息特征

2. 甲基化芯片篩選結(jié)果

850K 芯片對每例參與者的自身前后兩份樣本進(jìn)行檢測并評估全基因組 DNA 甲基化程度。共分析了 60 份血液樣本中 86 萬多個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。在研究終點(diǎn)，病例組和對照組之間有 2826 個(gè)顯著差異甲基化位點(diǎn)，在病例組自身前后，共有 78110 個(gè)顯著差異甲基化位點(diǎn)。為了達(dá)到在結(jié)核潛伏感染人群中鑒別診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的目的，作者選擇研究終點(diǎn)時(shí)病例組和對照組之間的差異甲基化位點(diǎn)，并且同時(shí)滿足病例組自身前后甲基化程度發(fā)生改變，對照組自身前后甲基化差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共得到 134 個(gè)甲基化位點(diǎn)作為候選分子標(biāo)識。

為了進(jìn)一步分析隨訪期間病例組和對照組之間的 2826 個(gè) dmCpGs 所在基因的生物學(xué)功能，進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析。通過 GO 功能分析，結(jié)果表明，dmCpGs 主要富集于胰島素分泌的生物過程中，涉及對葡萄糖刺激的細(xì)胞反應(yīng)、涉及吞噬作用的 Fc- γ 受體信號傳導(dǎo)途徑和鈣離子螯合的調(diào)節(jié)。KEGG 分類結(jié)果表明，這些 dmCpGs 主要富集在細(xì)菌感染性疾病和癌癥中。

圖 2   富集分析結(jié)果

在 134 個(gè)差異甲基化位點(diǎn)中，選擇位于 TSS 置 200bp 或者 TSS1500bp 的位點(diǎn)，共得到 8 個(gè)候選甲基化位點(diǎn)做進(jìn)一步分析，其中 6 個(gè)位點(diǎn)為高甲基化狀態(tài)，2 個(gè)位點(diǎn)為低甲基化狀態(tài)。

3. 差異甲基化的診斷效能

8 個(gè) dmCpGs 的 AUC 在 0.72 ~ 0.84 之間。其中，位于 SIRT1 基因 CPG 島啟動(dòng)子區(qū)的 cg12159502 位點(diǎn)呈現(xiàn)佳 AUC，為 0.84)，敏感度為 73.33%，特異度為 86.67%。按照 WHO 的 TPP 準(zhǔn)則，對于給定的 93.33% 的敏感度，cg14593639 的特異度高，為 66.67%。

表 2 8 個(gè)位點(diǎn)的區(qū)分能力評價(jià)

隨后，作者計(jì)算了 8 個(gè) dmCPGs 不同組合形式的診斷效能。共有 247 個(gè)不同的組合），有 52 個(gè)組合的診斷效能符合世界衛(wèi)生組織 TPP 基準(zhǔn)。其中，“SIRT1+SIRT5+GNB2L1+FLJ44635”組合表現(xiàn)佳，敏感度為 93.33%，特異度為 86.67%。

表 3 8 個(gè)位點(diǎn)的區(qū)分能力評價(jià)

初步結(jié)果提示，SIRT1 等基因 CPG 島啟動(dòng)子區(qū) DNA 高甲基化可能作為在 LTBI 人群中鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核的生物標(biāo)志物，在 LTBI 高危人群中進(jìn)行系統(tǒng)篩查不僅可以實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)病人，還可以快速的鑒別出活動(dòng)性肺結(jié)核患者并盡早對其開展預(yù)防性治療。考慮到亞臨床結(jié)核和病原學(xué)陰性的肺結(jié)核患者，與基于痰液樣本的檢測方法相比，基于血液的生物標(biāo)志物可大大提高診斷敏感性及時(shí)效性。鑒于納入研究樣本量有限，本研究結(jié)果尚需在大樣本的獨(dú)立人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

Du Y, Gao X, Yan J, et al. Relationship between DNA Methylation Profiles and Active Tuberculosis Development from Latent Infection: a Pilot Study in Nested Case-Control Design. Microbiol Spectr, 2022 Apr 21:e0058622. doi: 10.1128/spectrum.00586-22

來源：中國防癆雜志期刊社