抗 PD-(L)1 免疫檢查點抑制治療已成為晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的一線治療方案。對于早期可切除 NSCLC，近年來新輔助免疫治療的方案顯示出良好的治療前景。然而，仍然只有約 40% 的早期 NSCLC 在新輔助免疫治療后達到主要病理緩解（major pathologic response，MPR），大部分患者依舊對治療抵抗【1】。腫瘤微環境（Tumor microenvironment，TME）對于腫瘤治療耐藥有重要作用，而治療本身又可重塑 TME。解析免疫治療和 TME 的相互作用可能是解決 NSCLC 免疫治療抵抗的關鍵突破口。盡管免疫治療在晚期 NSCLC 已實踐多年，但是關于免疫治療對肺癌 TME 作用的研究仍然很缺乏。
近日， 同濟大學附屬上海市肺科醫院張鵬課題組與同濟大學生命科學與技術學院王晨飛課題組與合作，于 Genome Medicine 雜志在線發表題為 Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing 的研究論文 。 該研究利用單細胞及大量細胞轉錄組測序（single-cell and bulk RNA-seq）、非靶向代謝組學以及多色熒光染色系統刻畫 NSCLC 的 TME 在新輔助免疫治療中的動態變化，鑒定出新的生物標志物以及潛在的耐藥的新機制。
單細胞轉錄組測序由伯豪生物提供服務
在該研究中，作者收集了 15 例 IIIA 期 NSCLC 新輔助免疫治療前后的原發腫瘤樣本進行單細胞測序，這些樣本被分為治療前（treatment-na?ve，TN），治療后病理緩解組（MPR）以及非病理緩解組（NMPR）三組。此外作者還對另外 21 例新輔助免疫治療基線期的原發腫瘤樣本進行 bulk 轉錄組測序，作為獨立的驗證隊列 （圖一）。質控后總共獲得 92330 個單細胞，聚類后分為上皮細胞、T 細胞、B 細胞、髓系細胞等。作者首先探索了腫瘤細胞在治療前后轉錄特征。通過三個組間的對比，發現 MPR 組的腫瘤細胞呈現出免疫激活的特征（高表達免疫細胞趨化因子 CX3CL1 和 MHC-II 相關分子），而 NMPR 組則高表達雌激素代謝相關的基因（AKR1C1-3）以及富集雌激素相關的通路。進一步作者通過非靶向代謝組證實 NMPR 患者在治療過程中會出現血漿雌激素水平升高。
圖 1 研究樣本組成
接著研究人員進一步分析各個免疫細胞亞群的動態變化。對比 TN 組，MPR 和 NMPR 組的 CD8+ T 細胞和 NK 細胞均被激活，但是 MPR 組的殺傷性 CD8+ T 細胞和 CD16+ NK 細胞更多，且 Treg 更少。在 CD20+ B 細胞中，發現了一群高表達 CD86 的 FCRL4+FCRL5+ 非經典記憶 B 細胞亞群 【2】 富集在 MPR 患者中。進一步通過多色熒光染色發現這群 B 細胞位于三級淋巴結構（tertiary lymphoid structures，TLS）的中心部位。在獨立的驗證隊列中，MPR 患者基線期的這群 FCRL4+FCRL5+ B 細胞的富集程度更高。此外，作者在另外兩個黑色素瘤隊列中也發現這群 B 細胞在反應者的富集程度高于無反應者。細胞互作分析發現這群 B 細胞可以通過 CD86-CD28 和 CD40-CDLG 激活濾泡輔助 T 細胞（follicular helper T，Tfh）產生 IL21，而 IL21 可進一步激活 CD8+ T 細胞 【3】。
通過分析髓系細胞的異質性，作者發現 CD16+CX3CR1+ 的“巡邏”單核細胞 [4] 在 MPR 患者中富集，可能通過分泌 CFP 誘導腫瘤細胞凋亡。其信號的富集同樣可預測好的免疫治療效果 （圖 4）。由于采用 BD 單細胞測序平臺，作者獲得了較多的中性粒細胞。聚類后分為成熟和衰老的各兩個亞群，其中一群 CCL3+ 的衰老中性粒細胞在 MPR 中明顯減少且在 NMPR 組中增加，而這群衰老的中性粒高表達 PD-L1 和 IDO1 等免疫檢查點且趨化因子 IL8。通過細胞互作分析，作者發現 CCL3+ 的衰老中心粒可能和 SPP1+ 巨噬細胞存在著正反饋調節以互相促進增加：SPP1+ 巨噬細胞分泌 SPP1 誘導中性粒向衰老 CCL3+ 表型轉化，而這群中性粒則分泌 CCL3、CCL4 等趨化因子反過來招募更多的 SPP1+ 巨噬細胞。
綜上，本文利用臨床免疫治療前后的腫瘤以及外周血樣本，通過單細胞測序系統刻畫了免疫治療過程 TME 的變化，為后續肺癌免疫治療研究提供了珍貴的數據支持。 作者對比 MPR 和 NMPR 的 TME 差異，提出 FCRL4+FCRL5+ B 細胞、CD16+CX3CR1+ 單核細胞和血漿雌激素變化特征是新的生物標志物，并在獨立和公共轉錄組數據中驗證。結合 BD 平臺捕獲單細胞的優勢，系統分析了免疫過程中中性粒細胞和治療應答之間的關系。
同濟大學附屬上海市肺科醫院 張鵬 教授和同濟大學生命科學與技術學院 王晨飛 研究員為該論文共同通訊作者，同濟大學博士生 胡俊杰、嚴以律、 同濟大學附屬上海市肺科醫院助理研究員張樂樂和南昌大學醫學院碩士研究生夏浩然為共同第一作者。
原文鏈接：https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01164-9
參考文獻：
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3. Cui C, Wang J, Fagerberg E, Chen PM, Connolly KA, Damo M, et al. Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses. Cell. 2021; 184:6101-6118.e6113.
4. Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science. 2015; 350:985-990.
