病毒性神經(jīng)壞死是一種廣泛存在于海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病，主要影響海魚，并對養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。這種疾病是由神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus, NNV）引起的，它是一種分節(jié)段的正鏈 RNA 病毒，屬于野田病毒科（Nodaviridae）。NNV 是世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖魚類最重要的威肋之一，近年來受感染的魚類種類、數(shù)量和損害程度都迅速增加。NNVs 直徑約 25-30 nm，為二十面體結(jié)構(gòu)，無包膜，基因組由 2 段正鏈 RNA 組成。RNA1 編碼 RNA 依賴性 RNA 聚合酶（RdRp)和非結(jié)構(gòu)蛋白 B，RNA2 編碼衣殼蛋白（CP)。
圖 1. NNV 結(jié)構(gòu)示意圖
NNV 主要感染魚類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)，可造成 50 多種海洋和淡水硬骨魚的幼蟲和幼魚種群大量死亡，感染后 1 周內(nèi)死亡率可達 100%。到目前為止，四種不同的 NNV 物種已經(jīng)被國際病毒分類委員會正式認定：赤點石斑神經(jīng)壞死病毒（RGNNV）、擬鲹神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）、條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒（BFNNV）和紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒（TPNNV）。其中 RGNNV 傳播最為廣泛，感染這種病毒的魚表現(xiàn)出臨床癥狀，包括有不同程度的神經(jīng)異常行為（如不正常游動、喪失平衡能力、做螺旋或翻圈泳姿，靜止時腹部朝上）和體色變深等。RGNNV 不僅感染石斑魚，還感染許多其它經(jīng)濟價值較高的海洋魚類，包括歐洲鱸（Dicentrarchus labrax) 和日本真鱸（Lateolabrax japonicus)。
圖 2. NNV 衣殼蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析
目前，還沒有有效治療這些 NNVs 引起的疾病的方法。不過，如果能及早發(fā)現(xiàn)病毒，就可以采取有效措施，減少病毒對健康養(yǎng)殖魚類的傷害。因此，為了實現(xiàn)可用于及時止損的的養(yǎng)殖場檢測策略，建議在水產(chǎn)養(yǎng)殖期間使用分子檢測方法定期監(jiān)測，以確保魚類不受 RGNNV 感染。因此，開發(fā)一種快速、高靈敏度的檢測 NNVs 的方法對于疾病預(yù)防和控制至關(guān)重要。
01、基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 檢測原理
華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院王慶課題組開發(fā)了一種基于 CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)快速檢測赤點石斑神經(jīng)壞死病毒（RGNNV)的方法，該方法具有高靈敏度和高特異性，為 RGNNV 的即時現(xiàn)場檢測提供了新方案。
整個檢測過程如下，將 Cas13a 和 crRNA 進行共孵育形成 Cas13a/crRNA 復(fù)合物，該復(fù)合物可以特異性的識別 RGNNV 靶標核酸。當靶標被 crRNA 特異性識別后，Cas13a 的反式切割活性被激活，開始切割 RNA 報告探針，發(fā)出檢測信號。
圖 3. 基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 檢測原理
02、CRISPR/Cas13a 檢測靶標 RNA 的可行性分析
CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)依靠 crRNA 和 Cas13a 進行核酸檢測，通過增加或減少相關(guān)組分來驗證該檢測系統(tǒng)有效靶向 RGNNV 的可行性。結(jié)果表明，只有當檢測系統(tǒng)中所有組分都完整時，才會檢測到顯著的熒光信號。Cas13a 在 crRNA 引導(dǎo)下準確靶向到目標序列后，Cas13a 被激活并反式剪切 RNA 報告探針，發(fā)出熒光信號。
圖 4. CRISPR 系統(tǒng)檢測靶標 RNA 的可行性分析
03、CRISPR/Cas13a 檢測體系條件優(yōu)化
將 RNA 標準品和未擴增的樣本 RNA 分開檢測，測試發(fā)現(xiàn)，crRNA-CP 始終比 crRNA-RdRp 具有更高的檢測靈敏度。因此，使用 crRNA-CP 進行后續(xù)檢測。為了評估反應(yīng)溫度對檢測系統(tǒng)的影響，測試了 25℃、37℃和 45℃。反應(yīng)速度隨溫度升高而增加，45℃組熒光值達到平臺僅需 1 分鐘，37℃組需 5 分鐘，25℃組需 15 分鐘以上。37℃組的熒光信號比其他兩組更強，因此 37℃為最佳反應(yīng)溫度。接下來，測試了 RNA 報告探針濃度對檢測信號的影響，結(jié)果表明，探針濃度在 500～700 nM 范圍內(nèi)檢測效果最好。最后，發(fā)現(xiàn)當 Cas 蛋白與 crRNA 的分子比為 4:1、3:1 時，Cas13a 表現(xiàn)出飽和活性。通過調(diào)整分析系統(tǒng)中 Cas 蛋白與 crRNA 的濃度來找到最佳比例。當 Cas13a 的濃度一定時，更多的 crRNA 并沒有增加熒光信號。相比之下，當使用 Cas 蛋白與 crRNA 的濃度比例為 1:2 時獲得最高的檢測信號。Cas 蛋白與 crRNA 的濃度比例為 1:3 時，熒光信號開始減少。這些結(jié)果強調(diào)了適當?shù)?Cas 蛋白和 crRNA 濃度在檢測中的重要性。
圖 5. CRISPR/Cas13a 檢測體系條件優(yōu)化
04、檢測靈敏度評估
為了測試基于 CRISPR/Cas13a 檢測 RGNNV 的靈敏度，將 RGNNV 標準品 RNA 進行梯度稀釋，使用新構(gòu)建的方法進行檢測。加入目標 RNA 后，熒光信號發(fā)生了顯著變化。經(jīng)過優(yōu)化的檢測系統(tǒng)可以檢測到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。檢測儀器熒光采集結(jié)果顯示，當靶 RNA 濃度低于 102 fM 時，測得的熒光信號強度與空白對照無顯著差異；當濃度大于 102 fM 時，可以檢測到明顯的熒光信號。因此，優(yōu)化后的檢測系統(tǒng)可以檢測到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。
圖 6. 檢測 RGNNV 的靈敏度測試
05、檢測特異性評估
為了評估該檢測方法的特異性，使用同一系統(tǒng)檢測了 RGNNV、BFNNV 和 TPNNV 這三種病毒。BFNNV 的熒光信號強度與陰性對照沒有差異，但 TPNNV 引起了輕微的熒光信號（P<0.0001)，突出了該檢測系統(tǒng)對其預(yù)期靶標 RGNNV 的較高特異性。
圖 7. RGNNV 病毒檢測系統(tǒng)的特異性
06、各地區(qū)魚群樣本的檢測
從國內(nèi)不同地區(qū)收集的感染 RGNNV 的幼魚樣本進行了病毒 RNA 預(yù)處理和預(yù)擴增，然后與陰性對照進行測試，結(jié)果與 qPCR 結(jié)果一致（18
圖 8. 各地區(qū)魚群樣本檢測數(shù)據(jù)
總結(jié)
本研究建立了一種基于 CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)的 RGNNV 快速檢測方法。RGNNV 的最佳檢測系統(tǒng)包含 120 nM Cas13a、250 nM crRNA 和 600 nM RNA 報告探針，反應(yīng)體系在 37℃下孵育提高了切割效果。該方法特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準確度高，可以使用便攜式紫外燈或熒光檢測儀器進行檢測，比傳統(tǒng)檢測方法更具時效性、便捷性和簡單性，具有較高的應(yīng)用推廣前景。
參考文獻：
1.Huang F, Shan J, Liang K, et al. A new method to detect red spotted grouper neuro necrosis virus (RGNNV) based on CRISPR/Cas13a[J]. Aquaculture, 2022, 555: 738217.
2.Pascoli F, Guazzo A, Buratin A, et al. Lack of in vivo cross-protection of two different betanodavirus species RGNNV and SJNNV in European sea bass Dicentrachus labrax[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2019, 85: 85-89.
3. 陳文捷，劉曉丹，胡先勤，等。魚類神經(jīng)壞死病毒研究進展與發(fā)展趨勢[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2014, 38(9): 1666-1672.
