scRNA-seq 的原始數(shù)據(jù)格式和目前大多數(shù) scRNA-seq 分析過程都基于 FASTQ 文件（或壓縮格式 fq.gz）。Illumina 平臺(tái)測序數(shù)據(jù)默認(rèn)生成 BCL 格式文件，可以通過 CellRanger mkfastq 進(jìn)行轉(zhuǎn)換。scRNAseq 的分析流程包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、處理和擴(kuò)展下游分析（圖 4），其中數(shù)據(jù)預(yù)處理包括質(zhì)控、read 比對(duì)和表達(dá)量化；數(shù)據(jù)處理包括標(biāo)準(zhǔn)化、批次效應(yīng)校正、歸一化、特征選擇（HVG 選擇）、降維與聚類、細(xì)胞分型注釋、差異表達(dá)分析（DEGs）、可視化；擴(kuò)展下游分析包括擬時(shí)序、細(xì)胞間相互作用（CCI）、通路富集分析、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）等下游分析。整體來看，scRNAseq 分析方法層出不窮，沒有絕對(duì)完美適用于所有場景的方法，分析工具重要的是獲取生物學(xué)信息，難點(diǎn)在于選擇最合適的方法。本文中，我們將提出總結(jié)常見的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍提出建議。

圖 4：單細(xì)胞分析概覽。A. 在預(yù)處理階段，基于測序數(shù)據(jù)，細(xì)胞 - 基因矩陣讀數(shù)通過單細(xì)胞讀數(shù)校正和定量產(chǎn)生；B. 分析使用的高質(zhì)量細(xì)胞矩陣通過原始的基因表達(dá)矩陣獲得，通過去批次效應(yīng)矯正批次，通過標(biāo)準(zhǔn)化降低生物學(xué)差異，補(bǔ)充未檢測到的基因；C. 依照或不依照先前的參考信息對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行注釋；D. 轉(zhuǎn)錄組特征相似的細(xì)胞被歸為一類，稱為“細(xì)胞簇（cluster）”，細(xì)胞的可視化通過降維方法實(shí)現(xiàn)，差異基因分析對(duì)組間差異進(jìn)行檢驗(yàn)；E. 擬時(shí)序分析重建細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平變化的動(dòng)力學(xué)過程；F. 細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組調(diào)控關(guān)系可以通過胞間互作分析進(jìn)行推斷。

數(shù)據(jù)預(yù)處理

將原始測序數(shù)據(jù)通過濾除低質(zhì)量 reads 和環(huán)境干擾與參考基因組進(jìn)行比對(duì)和量化。從而得到每個(gè)細(xì)胞的特征計(jì)數(shù)矩陣和記錄其他信息的輔助文件，用于下游的數(shù)據(jù)分析（圖 4 A）。

1、質(zhì)控

由于測序儀器問題、人為操作、細(xì)胞自發(fā)情況，或存在空液滴、雙細(xì)胞、死細(xì)胞等，不可避免地會(huì)產(chǎn)生低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)（Chen 等，2019a ; Hao 等，2021b）。空液滴通常出現(xiàn)在液滴捕獲細(xì)胞外背景轉(zhuǎn)錄本而不是細(xì)胞時(shí)（Ilicic 等，2016 ; Kolodziejczyk 等，2015）。一種高度主觀的方法是根據(jù)曲線的膝點(diǎn)確定一個(gè) UMI 閾值，并過濾掉 UMI 計(jì)數(shù)低的細(xì)胞。隨后使用 DropEst (Petukhov 等，2018)、EmptyDrops (Lun 等，2019) 和 DIEM (Alvarez 等，2020) 增強(qiáng)過濾效果。DropletQC (Muskovic and Powell, 2021) 量化未剪接前 mRNA 含量的核分?jǐn)?shù)得分。MT 基因閾值雖然是衡量死細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，但它的選擇需要綜合考慮細(xì)胞生理因素 (Subramanian 等，2022)。近年來，基于深度學(xué)習(xí)的方法也應(yīng)運(yùn)而生，例如基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的 EmptyNN (Yan 等，2021) 和基于深度生成模型的 CellBender (Fleming 等，2019)，能夠有效識(shí)別空液滴中的背景轉(zhuǎn)錄本。

雙細(xì)胞是指兩個(gè)細(xì)胞包含在一個(gè)液滴中的情況，根據(jù)轉(zhuǎn)錄分布可分為同源雙峰和異源雙峰，均服從泊松統(tǒng)計(jì)量（Bloom, 2018）。絕大多數(shù)方法基于基因表達(dá)計(jì)算，利用先驗(yàn)知識(shí)或深度學(xué)習(xí)獲取單峰與雙峰細(xì)胞的差異，然后訓(xùn)練分類器進(jìn)行篩選，例如基于最近鄰的 DoubletFinder (McGinnis 等，2019a)、Scrublet (Wolock 等，2019)；基于反卷積的 DoubletDecon (DePasquale 等，2019)、基于變分自編碼器的 Solo (Bernstein 等，2020) 和基于集成算法的 Chord (Xiong 等，2021a)。此外，Scds 是另一種篩選方法，它依賴于基于共表達(dá)的雙聯(lián)體打分和基于二分類的雙聯(lián)體打分策略，實(shí)現(xiàn) scRNA-seq 表達(dá)數(shù)據(jù)的雙聯(lián)體分離 (Bais and Kostka，2020)。一些方法使用其他特征，例如 demuxlet 它使用自然遺傳變異信息指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)并通過計(jì)算進(jìn)行過濾 (Kang 等，2018)。

合理的質(zhì)控需要綜合考慮技術(shù)性和生物性因素，這也是當(dāng)前研究的主要方向。最近一種由生物數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的自學(xué)習(xí)無監(jiān)督質(zhì)控方法 ddqc 被提出來，用于確定各種 GC 指標(biāo)的具體閾值 (Macnair and Robinson，2023)。

2、reads 比對(duì)和定量

質(zhì)控后剩余的高質(zhì)量細(xì)胞需要將這些短 reads 映射到特定的參考基因組上進(jìn)行比對(duì)，以此對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。RNA 比對(duì)通常分為兩步：比對(duì) reads 以建立索引和映射 RNA 剪接序列，前一步與 DNA reads 比對(duì)共用，解決錯(cuò)配問題并設(shè)置索引參考；后一步是 RNA reads 比對(duì)所特有的，提供連通性信息。

早期二代測序結(jié)果是幾十對(duì)長度的堿基 reads。Seed-to-extend (Buhler，2001)（包括 MAQ (Li 等，2008a)、SOAP (Li 等，2008b)、CloudBurst (Schatz，2009)、ZOOM (Lin 等，2008)）、BurrowsWheeler 變換方法 (Burrows and Wheeler，1994)（包括 SOAP2 (Li 等，2009)、Bowtie (Langmead 等，2009)、BWA (Li and Durbin，2009)）、Needleman-Wunsch 方法（包括 Novocraft (Hercus，2009)）和 suffix-tree 算法方法（包括 MUMmer 2 (Delcher 等，2002)）都是百萬級(jí)短鏈 DNA 測序 reads 比對(duì)的有效工具。Bowtie 采用了一種依賴于 Burrows-Wheeler Transforming 的 FM-index 方法，如果 reads 有多個(gè)準(zhǔn)確匹配則結(jié)果只報(bào)告一個(gè)，與 MAQ（Ferragina and Manzini，2001）相比，大大優(yōu)化了運(yùn)行內(nèi)存和比對(duì)速度。BWA 是另一種基于 BWT 的比對(duì)方法，使用新的 SAM（Sequence Alignment/Map）格式輸出比對(duì)結(jié)果。基于 MAQ 和 Bowtie 兩種短鏈 DNA 比對(duì)算法，Cole Trapnell 于 2009 年提出了第一個(gè)針對(duì) NGS 數(shù)據(jù)的 RNA-seq 比對(duì)方法 TopHat，它使用 2 -bit-per-base 編碼實(shí)現(xiàn) reads 與哺乳動(dòng)物基因組中剪接位點(diǎn)的有效比對(duì)，而無需事先知道剪接位點(diǎn)的具體信息（Trapnell 等，2009）。

上述方法在堿基對(duì)長度超過 50 bp 時(shí)比對(duì)精度急劇下降（Gupta 等，2018 ; Lebrigand 等，2020）。NGS 單細(xì)胞測序分析主要采用兩類方法：基于 Bowtie2 的方法和基于 seed 策略的方法（Langmead and Salzberg, 2012）。Bowtie2 是 Bowtie 的升級(jí)版，保留了 FM-index 依賴的 BWT 算法核心，允許有間隙比對(duì)，并使用單指令多數(shù)據(jù)（SIMD）擴(kuò)展到長測序比對(duì)，同時(shí)提高運(yùn)行速度。Daehwan Kim 在 Bowtie2 基礎(chǔ)上，先后提出了 TopHat2（Kim 等，2013）和 HISAT（Kim 等，2015）。種子策略主要有 STAR（Dobin 等，2013）和 Subread（Liao 等，2013）。STAR 基于最大可映射前綴（MMP）的思想，采用順序檢索的策略，將與參考匹配的最長部分 reads 設(shè)為種子 1，其余 read 繼續(xù)匹配，依次從種子 2 調(diào)用至種子 n。值得注意的是，Rsubread 完全基于 R 語言平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了第一次 read 比對(duì)和基因量化的過程（Liao 等，2019）。

基因表達(dá)量化又可分為偽比對(duì)量化和基于 read 比對(duì)的量化。偽比對(duì)是指不采用上述嚴(yán)格的兩步法將所有 reads 比對(duì)到參考基因組上，包括選定的 k-mers 比對(duì)方法（Sailfish（Patro 等，2014）、Kallisto（Bray 等，2016）、Salmon（Patro 等，2017）、RapMap（Srivastava 等，2016）和 Barcode-UMI-Set (BUS) 比對(duì)方法 BUStools（Melsted 等，2019）。Kallisto-BUStools 是最新的工作流程，它使用 BUS 文件格式進(jìn)行初始數(shù)據(jù)預(yù)處理，與 BUStools 一樣，偽比對(duì)結(jié)果和量化計(jì)數(shù)都保存在 BUS 文件中（Melsted 等，2021）。另一方面，基于 reads 比對(duì)的方法依賴于 RNA reads 比對(duì)方法的結(jié)果來量化基因。CellRanger 是 10x Genomic 公司指定替代 Longranger 的官方開源數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件（Zheng 等，2017）。STARsolo 是替代 Cellranger 的 mapping/quantification 功能的工具，可實(shí)現(xiàn)多平臺(tái)測序數(shù)據(jù)的分析和基因表達(dá)之外的轉(zhuǎn)錄組特征的量化（Kaminow 等，2021）。其他基于 reads 比對(duì)的基因表達(dá)定量方法如 UMItools (Smith 等，2017)、zUMIs (Parekh 等，2018)、Alevin-fry (He 等，2022)、DropEst (Petukhov 等，2018)、RainDrop (Niebler 等，2020)、baredSC (Lopez-Delisle and Delisle, 2022)、BCseq (Chen and Zheng, 2018) 使用各種質(zhì)量過濾器和 barcode/UMI 處理策略在一定程度上提高了 CellRanger 的性能。

CellRanger 和 STARsolo 在處理包括 10x Chromium 在內(nèi)的各種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集時(shí)都具有良好的運(yùn)行速度，并且準(zhǔn)確度極高。但在獲得幾乎相同結(jié)果的前提下，后者相比前者提升了至少 5 倍的運(yùn)行速度，這也驗(yàn)證了 Alexander Dobin 等人使用 STARsolo 取代 CellRanger 的目的（Brüning 等，2022 ; Chen 等，2021a ; You 等，2021）。

數(shù)據(jù)處理

在對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行必要的調(diào)整（Normalization、Batch Effect Correction、Imputation）后，即可從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中充分挖掘出生物信息進(jìn)行分析。Seurat 和 Scanpy 分別基于 R 和 Python 對(duì)上述過程進(jìn)行模塊化、可擴(kuò)展的處理，是目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主流分析流程（Satija 等，2015 ; Wolf 等，2018）。常規(guī)分析流程和預(yù)期處理結(jié)果可參見總分析框架（圖 4 B-D）。

1、標(biāo)準(zhǔn)化

在測序過程中，技術(shù)原因或者細(xì)胞本身的生物學(xué)差異可能造成同一樣本內(nèi)（細(xì)胞之間）或者不同樣本之間的文庫大小差異（Marinov 等，2014）。無限數(shù)方法按照文庫大小進(jìn)行處理，按照具體原理大致可以分為基于全局縮放的標(biāo)準(zhǔn)化、spike-in 標(biāo)準(zhǔn)化和其他數(shù)據(jù)變換模型標(biāo)準(zhǔn)化。

全局縮放方法最初是為 bulk RNA 分析而發(fā)展起來的，通過特定的縮放因子對(duì)全局?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行縮放（Finak 等，2015）。每萬計(jì)數(shù)（CPT）變換和每百萬計(jì)數(shù)（CPM）變換是常見的線性縮放方法，在不考慮 spike-in count 的情況下，它們都對(duì)每個(gè) UMI/ 總 UMI count 等距縮放。其他標(biāo)準(zhǔn)化方法包括每百萬 reads 數(shù)（RPM）（Mortazavi 等，2008）、修剪均值 M 值（TMM）、DESeq（Robinson and Oshlack, 2010）、上四分位縮放（Bullard 等，2010）、FPKM（Trapnell 等，2010）、RPKM（Tu 等，2012）等，它們對(duì)于極值的穩(wěn)定性比線性縮放更好，因此與 RPKM/FPKM 一樣具有更廣泛的應(yīng)用范圍。但單獨(dú)使用該類方法進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，由于數(shù)據(jù)的稀疏性和假陽性率虛高，效果并不可接受（Evans 等，2018），與特定方法結(jié)合時(shí)往往需要改進(jìn)。SCnorm 使用分位數(shù)回歸方法來評(píng)估不同測序深度依賴細(xì)胞組之間的尺度因子（Bacher 等，2017）。bayNorm 基于基因原始計(jì)數(shù)與真實(shí)計(jì)數(shù)服從負(fù)二項(xiàng)（NB）分布的假設(shè)，使用集成貝葉斯模型對(duì) scRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（Tang 等，2020）。

spike-in 標(biāo)準(zhǔn)化方法可以看作是全局尺度方法的另一種擴(kuò)展，因?yàn)槌叨纫蜃邮歉鶕?jù) spike-in 基因計(jì)算出來的。需要注意的是，將 RNA spike-ins 的信息添加到其他方法中也可以提高 SCnorm 等標(biāo)準(zhǔn)化的效果。GRM 是一種基于 spike-in ERCC 分子濃度伽馬分布的方法，其中 ERCC 是測序中常用的校準(zhǔn)材料（Ding 等，2015）。BASiCS 是一種自動(dòng)貝葉斯標(biāo)準(zhǔn)化方法，將泊松分層模型應(yīng)用于 spike-in（技術(shù)）基因，以推斷細(xì)胞特定的標(biāo)準(zhǔn)化常數(shù)（Vallejos 等，2015）。

以上方法都是在細(xì)胞內(nèi) RNA 數(shù)量恒定的假設(shè)下對(duì)基因進(jìn)行縮放，而這可能具有欺騙性，因此其他轉(zhuǎn)化模型采用了不同的策略。由于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)存在零膨脹問題，一些模型就是為此而設(shè)計(jì)的，例如相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)（RLE）方法 ascend（Senabouth 等，2019）和基于 NB 的模型，如 Dino（Brown 等，2021）、scTransform（Hafemeister and Satija, 2019）。其他轉(zhuǎn)化模型歸一化方法如 MUREN 使用最小二乘（LTS）回歸算法（Feng and Li, 2021）；Sanity 使用從 UMI 計(jì)數(shù)推斷出的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)錄商（LTQ）作為貝葉斯框架的輸入，以避免泊松波動(dòng)，因?yàn)?LTQ 向量的變化估計(jì)了基因表達(dá)值（Breda 等，2021）；PsiNorm 是一種基于無監(jiān)督帕累托分布尺度參數(shù)的方法，用于提升標(biāo)準(zhǔn)化效率和準(zhǔn)確率（Borella 等，2021）。Charles Wang 比較了 sctransform、TMM、DESeq 等共 8 種標(biāo)準(zhǔn)化方法，其中 sctransform 和 logCPM（Seurat 的內(nèi)置處理方法）受數(shù)據(jù)影響最小，在可變數(shù)據(jù)集上最穩(wěn)定（Chen 等，2021a）。

2、批次效應(yīng)校正

由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測序平臺(tái)、測序時(shí)間、人員操作流程等原因，不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)在 mRNA 捕獲效率、測序深度等會(huì)存在明顯差異，從而產(chǎn)生樣本間的批次效應(yīng)（Chen 等，2019a；Hwang 等，2018；Tung 等，2017）。理論上可以通過實(shí)驗(yàn)策略消除技術(shù)變異，但由于實(shí)驗(yàn)過程的客觀限制以及測序儀器誤差，不可避免地會(huì)或多或少地引入批次效應(yīng)。利用計(jì)算方法進(jìn)行校正是解決不完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的必要手段，通常使用的方法可以分為相互最近鄰（MNN）方法、基于潛在空間的方法、基于圖的方法、DL 方法和其他方法。

MNN 首先識(shí)別出不同批次之間同一細(xì)胞類型的最相似細(xì)胞，然后利用這些細(xì)胞進(jìn)行批次效應(yīng)校正，包括 batchelor（Haghverdi 等，2018）、Scanorama（Hie 等，2019）、Canek（Loza 等，2022）。另一類使用 MNN 的方法是基于降維后的潛在空間，如 Seurat (Satija 等，2015)、BEER (Zhang 等，2019b)、SMNN (Yang 等，2021a)、iSMNN (Yang 等，2021b)。例如，Seurat 使用典型相關(guān)分析 (CCA) 潛在空間中的 MNN 對(duì) (稱為“錨點(diǎn)”）來匹配相似細(xì)胞，而 BEER 使用主成分分析 (PCA) 子空間來篩選相似性較差的子群。SMNN 和 iSMNN 分別采用監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)和迭代監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)來細(xì)化從預(yù)校正細(xì)胞聚類或迭代細(xì)胞聚類信息中訓(xùn)練出的 MN 對(duì)。

基于潛在空間的方法是指在隱藏空間或降維后的嵌入中進(jìn)行批次效應(yīng)校正的方法，除了基于 MNN 聚類的策略外，還有與 PCA 相關(guān)的空間方法 Harmony（Korsunsky 等，2019）、FIRM（Ming 等，2022）、Monet（Wagner, 2020）；t 分布隨機(jī)鄰域嵌入 (tSNE) 空間方法 sc_tSNE（Aliverti 等，2020）和 ZINBWaVE（Gao 等，2019）。Harmony 被廣泛用于去除樣本間的批次效應(yīng)，使用 PCA 方法將排序的細(xì)胞輸入到單個(gè)公共嵌入中，然后在最大多樣性聚類和線性批次校正之間迭代循環(huán)，直到為每個(gè)細(xì)胞分配一個(gè)特定的校正因子，可用于后續(xù)的批次效應(yīng)去除。Sc_tSNE 方法引入梯度下降算法對(duì)傳統(tǒng) t -SNE 算法進(jìn)行優(yōu)化，隨后采用線性校正（Aliverti 等，2021）。ZINB-WaVE 最初設(shè)計(jì)用于在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中進(jìn)行基因提取，Risso et al.（2018）將該方法擴(kuò)展至小批量優(yōu)化。

基于圖的方法利用細(xì)胞基因表達(dá)矩陣將數(shù)字信息轉(zhuǎn)化為空間構(gòu)造的圖，其中節(jié)點(diǎn)代表不同類型的批次，邊的權(quán)重基于不同的計(jì)算方法。BBKNN 利用 k 近鄰細(xì)胞構(gòu)建圖（KNN 圖），通過使用均勻流形近似與投影（UMAP）方法合并不同數(shù)據(jù)集間單個(gè)細(xì)胞的圖實(shí)現(xiàn)批次效應(yīng)校正，這也是 Scanpy 工作流程中的默認(rèn)方法（Pola ński 等，2020 ; Wolf 等，2018）。王波在 OCAT 中提出“幽靈細(xì)胞”（默認(rèn)為 k-means 算法聚類中心）來制作細(xì)胞連接的二分圖（Wang 等，2022a）。

近年來，深度學(xué)習(xí)方法的快速發(fā)展也為批次效應(yīng)校正提供了新思路，實(shí)現(xiàn)高效、大通量的數(shù)據(jù)處理，如 INSCT（Simon 等，2021）（三重態(tài)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）、CLEAR（Han 等，2022）（自監(jiān)督對(duì)比學(xué)習(xí)）、BERMUDA（Wang 等，2019e）（遷移學(xué)習(xí)）、iMAP（Wang 等，2021a）（VAE-GAN）、ResPAN（Wang 等，2022e）（Wasserstein GAN），一些新方法被證明在批次效應(yīng)校正方面有更好的效果；例如，基于從 SciBet 學(xué)習(xí)到的帶注釋數(shù)據(jù)集中的生物學(xué)先驗(yàn)知識(shí)，SSBER 可以在大型 RNA 測序數(shù)據(jù)集中去除批次效應(yīng)（Zhang and Wang，2021）。建議在整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之前，應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)的實(shí)際情況先測試多種方法，然后選擇最合適的批次效應(yīng)去除方法。例如，Jinmiao Chen 團(tuán)隊(duì)和 Charles Wang 團(tuán)隊(duì)分別于 2020 年和 2021 年對(duì)本綜述 2.2 中提到的前三種方法的大部分進(jìn)行了基準(zhǔn)測試，證明了 Harmony 和 Seurat V3 在大多數(shù)情況下都能達(dá)到良好的批次效應(yīng)校正效果，這符合這兩種方法如今仍然被廣泛使用，但對(duì)于深度學(xué)習(xí)方法來說仍然缺乏好的指標(biāo)這一事實(shí)（Chen 等，2021a；Tran 等，2020）。

3、填補(bǔ)

測序過程中會(huì)引入大量 0 值（高通量大規(guī)模 10x 基因組測序數(shù)據(jù)中零值可能超過 90%）（Stegle 等，2015 ; Talwar 等，2018），這會(huì)干擾下游生物學(xué)差異分析，因此必須對(duì)原始基因表達(dá)矩陣中的缺失數(shù)據(jù)值進(jìn)行填補(bǔ)，同時(shí)有效區(qū)分技術(shù)噪音零值與生物學(xué)零值。

基因 / 細(xì)胞分離方法主要應(yīng)用于早期的填補(bǔ)，其分別考慮細(xì)胞相似性（MAGIC (van Dijk 等，2018)、Sclmpute (Li and Li, 2018)、VIPER (Chen and Zhou, 2018)、RESCUE (Tracy 等，2019)、scRMD (Chen 等，2020a)、scRoc (Ran 等，2020)）或基因間關(guān)系（SAVER (Huang 等，2018a)、SAVER-X (Wang 等，2019a)、G253 (Wu 等，2021e)、DCA (Eraslan 等，2019)、DeepImpute (Arisdakessian 等，2019)）。總體而言，這些方法缺乏對(duì)數(shù)據(jù)集整體的考慮，容易導(dǎo)致過度插補(bǔ)或者引入誤差（Zhang 等，2019d）。綜合方法綜合考慮細(xì)胞與基因之間的聯(lián)系：CMF-Impute 和 netNMF-sc 是最早有效利用細(xì)胞與基因之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行插補(bǔ)的方法（Elyanow 等，2020；Xu 等，2020a）。scIGANs 通過特定的 GAN 模型處理基因表達(dá)矩陣，利用生成的細(xì)胞訓(xùn)練 GANs 模型來插補(bǔ) dropout（Xu 等，2020b）。近年來，新的方法還在不斷被提出，以更好地解決 dropout 之外的技術(shù)噪聲對(duì)數(shù)據(jù)的影響，并實(shí)現(xiàn)對(duì)生物零值的更好的區(qū)分。AutoClass（Li 等，2022c）實(shí)現(xiàn)了無監(jiān)督處理，而 ALRA 方法主要針對(duì)生物零值（Linderman 等，2022）。scMOO 進(jìn)行了根本性的改變，利用數(shù)據(jù)的潛在結(jié)構(gòu)來學(xué)習(xí)細(xì)胞相似性垂直結(jié)構(gòu)和總低秩結(jié)構(gòu)中的深度關(guān)聯(lián)，從而取得了比單一基因表達(dá)矩陣作為輸入更好的插值效果，但對(duì)內(nèi)存的要求也更高（Jin 等，2022a）。sc-PHENIX 利用 PCA-UMAP 初始化方法，實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的非線性插值（Padron-Manrique 等，2022），目前哪種插值能取得最佳效果尚無明確定論。由于數(shù)據(jù)集本身的原因，下游分析的目的會(huì)有不同的選擇，但毫無疑問最好的填補(bǔ)方法將能夠以較低的計(jì)算要求有效區(qū)分技術(shù)噪聲零值和生物零值（Jiang 等，2022a；Wen 等，2022）。

4、特征選擇

為了降低數(shù)據(jù)維數(shù)以提升計(jì)算分析效率、減少技術(shù)噪聲干擾和模型過擬合的風(fēng)險(xiǎn)，我們常常采取特征選擇策略，選取不同細(xì)胞中差異較大的基因，而非整個(gè)數(shù)據(jù)集基因進(jìn)行聚類等后續(xù)分析（Brennecke 等，2013；Jackson and Vogel，2022；Svensson 等，2017）。

在 bulk RNA-seq 分析中，尋找差異基因的方法通常包括基于倍數(shù)變化（FC）的方法、基于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法和 FC- 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法，顯然后者的篩選結(jié)果和可信度最好（Chung and Storey，2015）。

早期的單細(xì)胞特征選擇方法缺乏平均表達(dá)量與方差之間的校正，導(dǎo)致結(jié)果中高表達(dá)基因的比例過高（Brennecke 等，2013）。EDGE 采用大量弱學(xué)習(xí)器的集成學(xué)習(xí)方法來學(xué)習(xí)細(xì)胞間相似性概率，提取基于信息熵的顯著貢獻(xiàn)作為高可變基因（Sun 等，2020c）。同樣，SAIC 基于迭代聚類最終輸出實(shí)現(xiàn)了最優(yōu)細(xì)胞簇分離（Yang 等，2017）。近期，一些新的特征提取策略被提出并證明了其穩(wěn)定性和有效性，但它們之間的性能權(quán)威驗(yàn)證尚缺乏：包括基于基因表達(dá)分布矩陣的方法 SCMER（Liang 等，2021b）、RgCop（Lall 等，2021）、scPNMF（Song 等，2021a）、SIEVE（Zhang 等，2021e）；基于熵的方法 IEntropy（Li 等，2022g）、infohet（Casey 等，2023）；綜合考慮聚類的方法有 Triku（Ascensión 等，2022）、FEAST（Su 等，2021）等。由于上述方法絕大多數(shù)忽略了整體的依賴于基因表達(dá)的特征，因此提出了綜合的方法，如 Triku 使用 k 最近鄰圖的方法對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行綜合探索和分類，實(shí)現(xiàn)無偏差地篩選出更有生物學(xué)意義的特征基因；FEAST 在共識(shí)聚類上通過 f 檢驗(yàn)對(duì)特征進(jìn)行排序，并基于特征評(píng)估算法提取 HVG（Wang 等，2022c）。

其他一些方法使用高可變基因以外的特征來表示數(shù)據(jù)集，例如 scVEGs 和 scSensitiveGeneDefine 方法，使用高變異系數(shù)（CV）作為特征提取；BASiCS 方法利用 spike-in 基因的信息（Chen 等，2016b；Chen 等，2021b）。總體來看，基于準(zhǔn)確性、生物學(xué)可解釋性等角度，當(dāng)前特征選擇的主要目標(biāo)是有效提取 HVG，以便對(duì)高維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的下游分析。

5、降維

由于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組通常包含數(shù)萬個(gè)甚至更多的基因，不利于直接提取有效信息，在實(shí)際分析過程中，通常需要對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。除了利用前文提到的特征選擇方法處理高維單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)外，降維也是一種有效的方法，根據(jù)降維策略可分為線性降維（基于潛在狄利克雷分配（LDA）的方法、基于 PCA 的方法）和非線性降維（基于 t -SNE 的方法、基于 UMAP 的方法）（Andrews and Hemberg，2018；Becht 等，2019；Laurens and Hinton，2008；Peres-Neto 等，2005）。

在線性降維中，LDA 和 PCA 是兩種廣泛使用的算法，LDA 從分類最大的角度區(qū)分特征，而 PCA 則從方差最大的角度正交提取主成分。盡管有 JPCDA、LDA-PLS 等改進(jìn)算法，但是 LDA 模型在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的降維效果仍然不是最優(yōu)的（Tang 等，2014 ; Zhao 等，2020）。PCA 是另一種線性變換，Seurat 通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差 -PC 圖的拐點(diǎn)或者 PC 的比例檢驗(yàn)結(jié)果 P 值（ScoreJackStraw 函數(shù)）來確定 PC 數(shù)量的多少。其他基于 PCA 的降維方法的變體包括 pcaReduce（?urauskien ?和 Yau，2016），GLM-PCA（Townes 等，2019），RPCA（Gogolewski 等，2019），tRPCA（Candès 等，2011），scPCA（Boileau 等，2020），PCAone（Li 等，2022l）。GLM-PCA 將傳統(tǒng) PCA 分析擴(kuò)展到非正態(tài)分布，通過引入指數(shù)家族似然策略直接處理原始矩陣，使 PCA 擺脫正態(tài)化限制，然后使用偏差對(duì)基因?qū)崿F(xiàn)進(jìn)行排序和提取（Collins 等，2002）。ScPCA 使用對(duì)比 PCA 和稀疏 PCA 分別去除技術(shù)噪音和數(shù)據(jù)，進(jìn)一步增加了 PCA 的穩(wěn)定性（Abid 等，2018 ; Zou 等，2006）。由于大多數(shù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)集難以通過簡單的線性降維進(jìn)行有效表示，解決這一問題的第一個(gè)策略是基于快速 PCA 分析方法。PCAone 提出了一種新的快速隨機(jī)奇異值分解（RSVD）策略，在 35 分鐘內(nèi)完成 130 萬小鼠腦細(xì)胞單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析（Li 等，2022l）。

非線性降維是另一種解決方案，如非參數(shù)降維方法 t -SNE 和 UMAP，都需要預(yù)先設(shè)置聚類的超參數(shù)；而在分類效果上，前者傾向于離散數(shù)據(jù)中細(xì)胞的形成。在合理使用參數(shù)設(shè)定的情況下，UMAP 與 t -SNE 并無明顯差異，即在使用相同的信息初始化方法后，二者可以在保留數(shù)據(jù)集全局結(jié)構(gòu)的同時(shí)，產(chǎn)生近似的分析效率（Do and Canzar，2021；Kobak and Linderman，2021）。針對(duì) t -SNE 的改進(jìn)方法包括 net-SNE、qSNE、FItSNE、聯(lián)合 t -SNE（Cho 等，2018a；Linderman 等，2019；Wang 等，2022b），而 UMAP 的改進(jìn)主要來自于 Leland McInnes 課題組對(duì)該方法的自我改進(jìn)（McInnes 等，2018）。為了更好地可視化 t -SNE 或 UMAP 的降維結(jié)果，Hyunghoon Cho 提出了基于局部半徑依賴優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄組變異信息 den-SNE/densMAP 方法，以迭代優(yōu)化傳統(tǒng) t -SNE/UMAP 的功能；Stefan Canzar 提出了 j -SNE/jUMAP 來改善多模態(tài)組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合可視化結(jié)果，減少可視化的誤導(dǎo)性（Do and Canzar，2021；Narayan 等，2021）。

6、聚類

在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，通過聚類將細(xì)胞劃分為亞群，從而能夠表征多細(xì)胞生物中不同細(xì)胞類型，這有助于我們從細(xì)胞異質(zhì)性的角度準(zhǔn)確地分析不同的組織或發(fā)育過程。聚類的實(shí)際效果會(huì)受到數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟的影響，例如浴效應(yīng)歸一化、歸納、降維等。

在特征基因選擇和降維之后，絕大多數(shù)單細(xì)胞是基于距離進(jìn)行聚類的。K 均值聚類算法的概念被用于 SCUBA、SC3 和 RaceID 等應(yīng)用（Grün 等，2015；Kiselev 等，2017；Macqueen, 1967；Marco 等，2014）。在參數(shù)選擇改進(jìn)方面，SAIC 通過 Davies-Bouldin 指數(shù)迭代優(yōu)化多個(gè)初始中心 K 和 P 值，以獲得最優(yōu)解；LAK 將參數(shù)選擇算法應(yīng)用于數(shù)據(jù)集，實(shí)現(xiàn)參數(shù)的自動(dòng)選擇（Davies and Bouldin, 1979；Hua 等，2020；Yang 等，2017）。在超高維數(shù)據(jù)的操作中，LAK 添加 Lasso 懲罰項(xiàng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，mbkmeans 使用小批量 k 均值實(shí)現(xiàn)百萬細(xì)胞級(jí)別的快速聚類（Hicks 等，2021）。SMSC 應(yīng)用譜聚類方法來提高聚類性能，但對(duì)于超高維數(shù)據(jù)會(huì)損失一定的準(zhǔn)確性（Qi 等，2021）。另一大類廣泛使用的距離聚類方法依賴于共享最近鄰圖結(jié)構(gòu)和圖聚類，其中使用最廣泛的是 Louvain 或 Leiden（Blondel 等，2008；Xu and Su, 2015）。稀有細(xì)胞的識(shí)別需要結(jié)合特定方法進(jìn)行改進(jìn)，例如 dropClust 使用局部敏感哈希工作流篩選最近鄰，然后是 Louvain 聚類，它使用指數(shù)衰減函數(shù)來保留更多稀有細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征（Sinha 等，2018）。其他基于距離的聚類方法使用不同的算法核心：SIMLR 使用高斯核學(xué)習(xí)模型為數(shù)據(jù)集中潛在的 C 細(xì)胞群體構(gòu)建核矩陣，而 Conos 提出聯(lián)合相互最近鄰（mNN）圖聚類來實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)不同單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣本的整合分析（Barkas 等，2019 ; Wang 等，2017a）。基于密度的聚類利用樣本分布的接近程度進(jìn)行聚類，DBSCAN 是最經(jīng)典的算法（Ester 等，1996 ; Fukunaga and Hostetler, 1975）。對(duì)于單細(xì)胞測序，densityCut 和 FlowGrid 就是基于此原理設(shè)計(jì)的（Ding 等，2016 ; Fang and Ho, 2021）。層次聚類是一種自下而上的聚類方法，通過無監(jiān)督學(xué)習(xí)，不斷重復(fù)計(jì)算細(xì)胞與細(xì)胞的相似性進(jìn)行分類，直至完成預(yù)設(shè)的聚類數(shù)（Guo 等，2015）。隨后，RCA 聚類采用常規(guī)的層次聚類方法，對(duì)映射到全局參考面板的細(xì)胞進(jìn)行聚類；HGC 在 SNN 圖上構(gòu)建層次樹（Li 等，2017；Zou 等，2021）。為了解決常規(guī)層次聚類方法難以對(duì)某一組細(xì)胞進(jìn)行聚類、只允許同一組特征基因進(jìn)行聚類的缺陷，K2Taxonomer 采用約束 K 均值算法擴(kuò)展到樣本組，基于多個(gè)基因集遞歸進(jìn)行積分計(jì)算，以捕獲各種分辨率下的亞組（“類似分類學(xué)的細(xì)胞”）（Reed and Monti, 2021）。Mrtree 將層次聚類的策略應(yīng)用于平面簇的多個(gè)劃分，并構(gòu)造多分辨率協(xié)調(diào)樹用于細(xì)胞聚類（Peng 等，2021a）。最近，Zelig 和 Kaplan（2020）提出了一種 KMD 聚類方法，通過平均鏈接層次聚類模型在聚類時(shí)消除了超參數(shù) K，大大減少了主觀性帶來的判斷誤差。

深度學(xué)習(xí)聚類方法是將機(jī)器學(xué)習(xí)方法與上述單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聚類策略相結(jié)合，可以以無監(jiān)督、監(jiān)督或半監(jiān)督的形式實(shí)現(xiàn)更高效的聚類結(jié)果。這些方法傾向于學(xué)習(xí)一種非線性變換，通過將原始高維數(shù)據(jù)映射到較小的潛在空間中來獲得最佳的低維表示。總體而言，這種方法避免了傳統(tǒng)聚類方法對(duì)聚類前數(shù)據(jù)處理方法選擇的影響。無監(jiān)督聚類方法包括 ADClust、DESC、SAUCIE、VAE-SNE 等，通常不需要預(yù)設(shè)聚類個(gè)數(shù)等參數(shù)，以自主學(xué)習(xí)的方式完成對(duì)數(shù)據(jù)集的分析處理（Amodio 等，2019；Graving and Couzin，2020；Li 等，2020c；Zeng 等，2022c）。雖然無監(jiān)督聚類方法避免了手動(dòng)輸入聚類個(gè)數(shù)等參數(shù)，可以延伸到超高維細(xì)胞聚類，但有時(shí)利用高質(zhì)量標(biāo)注數(shù)據(jù)集或其他先驗(yàn)知識(shí)輔助約束進(jìn)行監(jiān)督或半監(jiān)督聚類，可以實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確的細(xì)胞類型分類，提高聚類性能（Bai 等，2021）。基于遷移學(xué)習(xí)的 ItClust、基于互監(jiān)督 ZINB 自編碼器和圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（GNN）的 scDSC、基于軟 K 均值卷積自編碼器的 ScCAE、基于 Cramer-World 距離最大均值懲罰高斯混合自編碼器的 SeGMA、基于時(shí)間序列聚類網(wǎng)絡(luò) STCN 都是廣泛使用的監(jiān)督聚類（Gan 等，2022 ; Hu 等，2022a ; Hu 等，2020a ; Ma 等，2021b ; Smieja 等，2021）。此外，Zhang 團(tuán)隊(duì)（Yang 等，2023b）利用分層 GAN 設(shè)計(jì)了另一種廣泛使用的深度學(xué)習(xí)方法 IMDGC，用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，以生成的方式構(gòu)建細(xì)胞嵌入簇。

針對(duì)聚類中的特殊情況，設(shè)計(jì)了有針對(duì)性的聚類方法：GiniClust（Jiang 等，2016）（更新為 GiniClust 3（Dong and Yuan，2020）、MicroCellClust（Gerniers 等，2021）用于稀有細(xì)胞亞群聚類；EDClust（Wei 等，2022）、ENCORE（Song 等，2021b）和 MLG（Lu 等，2021）用于降噪和消除批次效應(yīng)；ClonoCluster（克隆起源信息）（Richman 等，2023）、IsoCell（可變剪接信息）（Liu 等，2023）使用附加信息進(jìn)行聚類。Wu 和 Yang 從特征選擇對(duì)聚類的影響的角度對(duì)聚類方法進(jìn)行了評(píng)估，他們證明更具代表性的特征選擇會(huì)提高細(xì)胞聚類的水平，基于“聚類相似性”的方法（我們綜述中提到的大多數(shù)基于距離的聚類方法）通常具有廣泛的高聚類類型性能；然而，高精度和高運(yùn)行速度需要根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)集進(jìn)行有針對(duì)性的選擇（Su 等，2021；Yu 等，2022）。雙重浸入 (double dipping) 是一個(gè)顯著的問題，即在細(xì)胞聚類和差異表達(dá)基因中使用相同的表達(dá)數(shù)據(jù)，導(dǎo)致在細(xì)胞聚類不正確時(shí) DE 基因的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR) 過高。例如，如果只存在一個(gè)特定的細(xì)胞聚類，則不應(yīng)將任何基因視為差異基因。為了系統(tǒng)地解決這個(gè)問題，ClusterDE 采用了聚類對(duì)比學(xué)習(xí)策略進(jìn)行聚類后 DE 測試。該方法與截?cái)嗾龖B(tài)分布 (TN) 檢驗(yàn)和 Countsplit 方法相比，在不同閾值范圍內(nèi)具有更好的 FDR 控制 (Song 等，2023a)。

7、細(xì)胞類型注釋

細(xì)胞分型注釋是指利用特定的信息對(duì)單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞或細(xì)胞亞群進(jìn)行注釋，作為后續(xù)生物學(xué)分析的基礎(chǔ)。最常用的策略是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類，然后根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行注釋，例如 scCATCH、SCSA (Cao 等，2020b；Shao 等，2020a)，但它難以處理復(fù)雜的高維數(shù)據(jù)集 (Franzén 等，2019；Luecken and Theis, 2019；Zhang 等，2019c)。目前已經(jīng)開發(fā)了多種自動(dòng)細(xì)胞分型方法，大致可分為兩類，即依賴參考和無參考的注釋方法。

依賴參考信息的注釋方法要求用戶提供預(yù)先注釋的高質(zhì)量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集或來自 PanglaoDB 數(shù)據(jù)庫、ScType 數(shù)據(jù)庫等的先驗(yàn)知識(shí)進(jìn)行比對(duì)（Ianevski 等，2022）。根據(jù)方法原理的不同，可分為基于層次樹的方法（CHETAH（de Kanter 等，2019）、Garnett（Pliner 等，2019）、HieRFIT（Kaymaz 等，2021）、scHPL（Michielsen 等，2021）、scMRMA（Li 等，2022e）、基于相似性的方法（SingleR（Aran 等，2019）、scmap（Kiselev 等，2018）、deCS（Pei 等，2023）、scID（Boufea 等，2020）、scMatch（Hou 等，2019）、Symphony（Kang 等，2021）、基于簽名基因的方法（Cellassign（Zhang 等，2021）、基于特征基因的方法（Cellassign（Zhang 等，2022）。al., 2019a )、Cell-ID（Cortal 等，2021）、scMAGIC（Zhang 等，2022g）、SciBet（Li 等，2020b）和其他 DL 方法。作為早期方法，ACTINN 是一種使用 3 個(gè)隱藏層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行注釋分類的深度學(xué)習(xí)方法（Ma and Pellegrini, 2020）。SCPred 隨后提出了一種基于嵌入的無偏特征選擇的機(jī)器學(xué)習(xí)概率預(yù)測方法（Alquicira-Hernandez 等，2019）。其他方法如 Seurat 在 PCA 空間中投影查詢細(xì)胞并通過加權(quán)投票分類器訓(xùn)練細(xì)胞分型注釋；scSorter 采用高斯混合模型，GraphCS 使用虛擬對(duì)抗訓(xùn)練 (VAT) 損失修改的 GNN 來擴(kuò)展到多物種、大規(guī)模細(xì)胞注釋數(shù)據(jù)集（Guo and Li，2021；Zeng 等，2022a）。

不依賴參考信息的注釋方法使用預(yù)先訓(xùn)練的深度學(xué)習(xí)模型，可以直接使用查詢數(shù)據(jù)集作為輸入進(jìn)行細(xì)胞分類。scDeepSort 使用來自人類細(xì)胞圖譜 (HCL) 和小鼠細(xì)胞圖譜 (MCA) 數(shù)據(jù)庫的單細(xì)胞圖譜作為預(yù)訓(xùn)練加權(quán) GNN 模型的輸入，該模型適用于人類和小鼠細(xì)胞注釋并取得良好的效果（Han 等，2018b；Han 等，2020；Shao 等，2021b）。類似地，Pollock 是一個(gè)預(yù)訓(xùn)練的人類癌癥參考 VAE 模型，用于對(duì)癌癥環(huán)境中的多模態(tài)細(xì)胞進(jìn)行分類（Storrs 等，2022）。雖然使用起來更方便，但對(duì)于差異顯著的查詢數(shù)據(jù)集難以達(dá)到更好的細(xì)胞注釋效果，而且由于準(zhǔn)確性和預(yù)訓(xùn)練參考數(shù)據(jù)集的數(shù)量也難以擴(kuò)展應(yīng)用。還有一些其他用于有針對(duì)性領(lǐng)域研究的細(xì)胞注釋工具，例如，用于人類腎細(xì)胞注釋的 DevKidCC（Wilson 等，2022），用于識(shí)別癌癥和正常細(xì)胞的 ikarus（Dohmen 等，2021）。總體而言，無參考注釋方法的性能受到預(yù)訓(xùn)練參考數(shù)據(jù)集的覆蓋率和準(zhǔn)確性的制約。

目前，改進(jìn)細(xì)胞注釋工具以在大平臺(tái)和多細(xì)胞模式下統(tǒng)一分配細(xì)胞類型是細(xì)胞注釋研究的主流方向，最新的 Cellar 和 ELeFHAnt 方法在這方面做了一些嘗試并取得了初步成果（Hasanaj 等，2022 ; Thorner 等，2021）。總體而言，基于相似性的注釋方法計(jì)算量大，在應(yīng)用于非常大的查詢和參考數(shù)據(jù)集時(shí)，往往會(huì)在準(zhǔn)確率和速度之間做出權(quán)衡，因此一般只適合在較小的數(shù)據(jù)集中進(jìn)行細(xì)胞分類；對(duì)于較大規(guī)模的數(shù)據(jù)集，建議使用 F 檢驗(yàn)特征選擇或 MLP 分類器（Hu 等，2020a ; Huang and Zhang, 2021 ; Ma 等，2021c）。此外，半監(jiān)督遷移學(xué)習(xí)的方法，如 Itclust，在發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞型方面也有不錯(cuò)的效果。近年來，基于上述參考注釋方法分類的新方法不斷完善，VAE 等深度學(xué)習(xí)模型也在該領(lǐng)域得到應(yīng)用。

8、差異表達(dá)分析（DEG）

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)是 Bulk RNA-seq 的差異基因分析中常用到的方法，類似章節(jié) 2.4HVG Selection 算法：通常以 P 值和對(duì)數(shù)倍變化量作為重要參數(shù)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包括 t 檢驗(yàn)（兩個(gè)樣本為基礎(chǔ)），Wilcoxon 檢驗(yàn)，Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)（KS 檢驗(yàn)），Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)（KW 檢驗(yàn)），其中一些在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 DEGs 的檢驗(yàn)中也被廣泛使用。基于此，發(fā)展了相應(yīng)的檢測工具：limma（Ritchie 等，2015），edgeR（Robinson 等，2010），DESeq2（Love 等，2014）。limma 和 edgeR 算法均由 Smyth GK 提出，前者基于正態(tài)或近似正態(tài)分布模型，后者基于過度離散的泊松分布模型。DESeq2 基于 NB 分布模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，對(duì) DEG 采用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯程序。目前 limma 由于特定的分布模型假設(shè)，在 RNA 計(jì)數(shù)分析中誤差較大，雖然 edgeR 和 DESeq2 都利用貝葉斯模型對(duì)過度離散進(jìn)行歸一化，但后者通過數(shù)據(jù)集 reads 的平均值和異常值檢測促進(jìn)了 CPM 閾值的篩選，分析效果更好。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 DEG 按照時(shí)間和分析方法大致可以分為早期零值參數(shù)檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)和其他方法。由于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中存在大量零數(shù)，早期的方法大多基于此觀察做參數(shù)檢驗(yàn)，例如 Monocle (Trapnell 等，2014)、SCDE (Kharchenko 等，2014)、MAST (Finak 等，2015)、scDD (Korthauer 等，2016)、D3E (Delmans and Hemberg, 2016)、TASC (Jia 等，2017)、DEsingle (Miao 等，2018) 和 HIPPO (Kim 等，2020b)。對(duì)以上一些方法的評(píng)測表明，雖然它們在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的分析中普遍取得了不錯(cuò)的效果，但對(duì)于批量數(shù)據(jù)（Soneson and Robinson, 2018）相比 DEA 方法并沒有明顯的性能提升。對(duì)于不同的數(shù)據(jù)集，有可能沒有最好的分布模型，因此一種替代解決方案是考慮非參數(shù) DEA 方法。

非參數(shù)檢驗(yàn)或無分布檢驗(yàn)不需要對(duì)數(shù)據(jù)分布形式做事先假設(shè)，因此適用于多數(shù)據(jù)集的分析，常用方法有 Swish（Zhu 等，2019a）、IDEAS（Zhang 等，2022d）、ccdf（Gauthier 等，2021）、distinct（Tiberi 等，2022）。Swish 通過 Salmon Gibbs 評(píng)估轉(zhuǎn)錄本水平，然后用 Mann-Whitney Wilcoxon 檢驗(yàn)計(jì)算 FC 值。IDEAS 是一種使用 Jensen-Shannon 散度（JSD）或 Wasserstein 距離（Was）進(jìn)行基因差異表達(dá)測量的偽 F 統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)，P 值由基于 PERMANOVA 的距離測試器基于核的回歸生成。Ccdf 是一種依賴條件累積分布函數(shù)的條件獨(dú)立性檢驗(yàn)，通過多元回歸模型預(yù)測 DEG。Distinct 提出了一種分層非參數(shù)置換方法，使用經(jīng)驗(yàn)累積分布函數(shù) (ECDF) 的總距離進(jìn)行 DEG 識(shí)別。替代方法包括深度學(xué)習(xí)策略 MRFscRNAseq (Li 等，2021a)、基于擬時(shí)序推斷的 PseudotimeDE (Song and Li, 2021)、基于非預(yù)聚類的 singleCellHaystack (Vandenbon and Diez, 2020)、基于多重評(píng)分的 MarcoPolo (Kim 等，2022)。建議不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集應(yīng)采用數(shù)據(jù)特定的 DEGs 檢測策略，以優(yōu)化 DEGs 分析，基于 scCODE 工作流程，可以使用涉及 CDO（DE 基因順序）和 AUCC（一致性曲線下面積）的指標(biāo)找到最優(yōu)化的 DEGs 方法（Zou 等，2022）。此外，研究方法在不同的研究背景下會(huì)有特定的研究取向，例如在給藥后的劑量反應(yīng)研究中，DEGs 分析、LRT 線性檢驗(yàn)和貝葉斯多組檢驗(yàn)均比其他方法有更好的結(jié)果（Nault 等，2022）。

9、可視化

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可視化是指將上述分析結(jié)果以圖形的形式直觀地呈現(xiàn)，ggplot2 是 R 中最廣泛的可視化工具，在 R 中被廣泛使用，可以大大增強(qiáng)繪圖能力（Wickham，2009）。ARL 是另一個(gè)專門顯示標(biāo)記基因關(guān)聯(lián)圖并可顯示其在每個(gè)簇中的特征的 R 包（Gralinska 等，2022）。此外，還有其他專門用于標(biāo)記基因可視化的包，如 Complex Heatmap，本文不再詳細(xì)介紹。HVG 可視化通常以火山圖的形式呈現(xiàn)，默認(rèn)情況下，圖的左側(cè)和右側(cè)部分分別是代表性不足的基因和代表性過高的基因，而中間是恒定基因。Enhanced Volcano 是一個(gè)專門用于繪制火山圖的 R 包，默認(rèn)情況下也可以使用 ggplot2 來獲得更好的結(jié)果。簇可視化通常以 PCA 圖、t-SNE 圖和 UMAP 圖呈現(xiàn)，但值得注意的是，可視化的結(jié)果非常具有欺騙性，因?yàn)橐恍┬〉募?xì)胞亞群可能代表 UMAP 圖中顯示的大量細(xì)胞。為了解決這些問題，提出了 den-SNE/densMAP、j-SNE/j-UMAP 等改進(jìn)方法（Macqueen，1967；Marco 等，2014）。此外，F(xiàn)astProject 可以輸出注釋簇的 2D 顯示，PieParty 可以在簇 2D 圖中為每個(gè)基因繪制顏色圖（DeTomaso and Yosef，2016；Kurtenbach 等，2021）。

同時(shí)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的交互式可視化是目前的熱門領(lǐng)域，諸如 Single Cell Explorer 等軟件可以一定程度上實(shí)現(xiàn)交互式可視化，但仍需增加交互自由度，以提供更全面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 3D 呈現(xiàn)（Cakir 等，2020；Feng 等，2019）。為此，CellexalVR 利用 VR 理論進(jìn)行交互可視化；CellView 是一個(gè)基于 Web 的工具，包括用于不同用途的探索選項(xiàng)卡、共表達(dá)選項(xiàng)卡、子簇分析選項(xiàng)卡模塊；Cellxgene VIP 是一個(gè)基于 cellxgene 框架的插件，并擴(kuò)展到基于多個(gè)模塊組合的 ST 數(shù)據(jù)的交互式可視化（Bolisetty 等，2017 ; Legetth 等，2021 ; Li 等，2022f）。

10、單細(xì)胞模擬

隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組方法的不斷擴(kuò)展，基準(zhǔn)測試成為了重要挑戰(zhàn)，關(guān)鍵問題是需要穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，因?yàn)閱渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組的直接測序可能缺乏基本事實(shí)。真實(shí)的單細(xì)胞模擬數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)測試提供了已知的事實(shí)，允許使用真實(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，同時(shí)匹配實(shí)際數(shù)據(jù)的特征。此外，模擬數(shù)據(jù)比真實(shí)數(shù)據(jù)提供了更大的靈活性，使分析師能夠根據(jù)特定的測試方法調(diào)整諸如 dropout rate 等參數(shù)。

Splatter 是一個(gè)兩步模擬框架，首先模擬來自真實(shí)數(shù)據(jù)的估計(jì)參數(shù)，然后合并來自用戶的額外參數(shù)（Zappia 等，2017）。其六個(gè)預(yù)先設(shè)計(jì)的管道模塊接口確保了數(shù)據(jù)生成的可重復(fù)性。最近的更新側(cè)重于專業(yè)化和泛化。在專業(yè)化領(lǐng)域，splaPop 生成具有遺傳效應(yīng)（數(shù)量性狀基因座）的人口規(guī)模數(shù)據(jù)，而 dyngen 模擬動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程，如發(fā)育軌跡（Azodi 等，2021；Cannoodt 等，2021）。在泛化領(lǐng)域，Li 的團(tuán)隊(duì)介紹了理想模擬的六個(gè)概念，包括真實(shí)性、基因的保存、基因相關(guān)性的捕獲、穩(wěn)健性、參數(shù)可調(diào)性和效率（Song 等，2023b；Sun 等，2021）。隨后，scDesign2 提出來滿足所有 6 個(gè)屬性（Sun 等，2021），接著是 scDesign3，解決單細(xì)胞組學(xué)統(tǒng)計(jì)模擬的空白（Song 等，2023b）。模擬準(zhǔn)確性和透明度的提高增強(qiáng)了不同單細(xì)胞數(shù)據(jù)處理方法之間的基準(zhǔn)測試，指導(dǎo)選擇最合適的方法以滿足特定數(shù)據(jù)和許可需求。